【正文】 系列 方法特點： 設備和操作簡單，靈敏度高 ,可在白光下進行，不符合比爾定律的試液亦可以進行測定。 目視比色法 （ 2）標準曲線法 標準曲線法又稱校正曲線法。取一系列不同濃度標準溶液，分別測定其吸光度，以 濃度 c為橫坐標 ， 吸光度為縱坐標 ，作校正曲線。 測量方法： 先配制一系列標準溶液，在最大吸收波長處，測出它們的吸光度，作圖，同條件測未知液的吸光度，從圖中查出未知液的濃度。 根據(jù)兩個液層厚度相同而濃度不同的同一種有色溶液，它們的濃度與吸光度成正比： A標 = ? 1c標 A試 = ? 2c試 由于有色溶液性質一致，入射光波長也一致，因此 ? 1= ? 2,故有： A標 /A試 =c標 /c試 故： c試 ＝ A試 c標 /A標 采用比較法時， c標 與 c試 必須相近，結果才可靠。 操作步驟： 樣品處理： 稱取 ，置于 50mL燒杯中，加入 ，攪拌均勻，以 70℃ 左右的水約 150mL將樣品全部洗入 250mL容量瓶中，置沸水浴中加熱 15min，取出后冷至室溫，然后邊轉動邊加 亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入 蛋白質，加水至刻度，混勻，放置 ，除去上層脂肪，清液用濾紙過濾棄去初濾液 20mL，濾液備用。 （ 2）樣品測定：吸取 20mL上述濾液于 25mL比色管中，按標準曲線繪制同樣操作，于波長 538nm處測吸光度，從標準曲線上查出樣品液含亞硝酸鹽含量。 (如顯色劑在最大吸收波長處有吸收則必須重新考慮 ) 4. 定量分析條件的選擇 A/ 選擇合適的入射光波長 用光度計測量吸光度，都存在著誤差。為了使測量范圍落在 ～ ，可以采取以下 措施 : （ a）改變待測溶液濃度 ,來控制吸光度范圍。 （ b）如果試樣已經顯色 ,可通過改變比 色皿厚度來控制 A值。同一儀器，△ T 基本上是一個常數(shù)。 cc? TTTcclg4 3 4 ???要使測定結果的相對誤差最小，對 T求導數(shù)應有一極小值，即： %0)TlgT()( l TlgTT0 4 3 4 dTd2＝或解得： ???????????? ?A = 若△ T=%， T = ,則最小相對誤差為 %。 C/ 出射狹縫寬度 的選擇 出射狹縫寬度影響測定的靈敏度和標準曲線的線性范圍。中低檔儀器的出射狹縫寬度是固定的，若可以調節(jié)時，應在確保一定入射光強度時，選擇較小的狹縫寬度。通常是固定其它反應條件： cM和 pH等，改變 c來獲得最佳濃度范圍 : 溶液的酸度對顯色反應的影響是多方面的 ： 例如由于顯色劑大多是有機弱酸，酸度影響顯色劑的離解，因而影響顯色劑反應的完全程度。 二甲酚橙 pH， pH，與金屬配合物則呈紅色，故只適合于 pH。 （ 3）參比溶液的選擇 選用光學性質相同 ,厚度相同的比色皿貯參比溶液調節(jié)儀器 ,使透過參比皿的吸光度為零。 試液參比IIIIA lglg 0 ??參比溶液的作用： 用它來抵消比色皿及試劑對入射光的反射和吸收，也可以抵消一些有色干擾離子的影響。 （ 4）干擾及消除方法 有的干擾離子本身有顏色，如 Cu2＋ （藍）、 Co2＋ （紅）、 Cr3+（綠）、 Fe3＋ （黃）； 有的與試劑生成有色配合物，如硅鉬藍法測Si時， P、 As也與鉬酸銨生成雜多酸且同時被還原成鉬藍干擾測定； 有的與試劑或被測離子生成更穩(wěn)定化合物，使被測離子配位不完全等。 （ 1）加入配位劑掩蔽干擾離子 如測 Ti4＋ 時， Fe3＋ 黃色干擾，可加 H3PO4使其成為 Fe(PO4)3－ （無色 ）。 （ 3）根據(jù)配合物的穩(wěn)定性不同實現(xiàn)分離 （ 4）選擇合適的測定波長 若顯色物質存在多個吸收峰且在 ?max處存在干擾時，可選擇吸收次強的峰以避開干擾，但測定靈敏度會降低。 （ 5）提高靈敏度及選擇性的方法 ① 合成或改進新的高靈敏、高選擇的有機顯色劑； ② 分離富集和測定相結合，如用有機溶劑萃取顯色產物再進行光度測定； ③ 采用三元（或多元）配合物顯色體系。需采用 示 差法。 5. 其他定量分析方法 示 差 法原理 參比溶液： 濃度稍低的標準溶液 c1。 A1= ? l c 1 A2= ? l c 2 結論： 兩溶液的吸光度差 △ A與濃度差 △ c成正比。以 c1作參比，調 A = 0 測 c c3……的△ A，用△ A對△ c作圖。 從示差工作曲線中查出△ cx. cx = △ cx + c1 △ A △ c △ Ax △ cx 示差工作曲線 示差法標尺擴展原理： 普通法： cs的 T=10%； cx的 T=5% 示差法： cs 做參比，調 T=100% cx的 T=50% ；標尺擴展 10倍 示差光度法 例：若普通的分光光度法測得試樣的T=%，配制一濃度稍低的標準溶液 S，測得 T=%， 二者之差為 3%；用示差法時，以此標準溶液 S來調節(jié)儀器令T=100%，再來測定試樣 X，可得T=%， 二者之差為 30%。 準確度提高的原因： ?使讀數(shù)落入測量誤差最小區(qū)域（可稀釋解決） ?相對誤差 dc/(?c+cs)很小，從而結果可靠。 不同濃度標準溶液作參比時的 誤差曲線 測量誤差 ， 但是 濃度越高 ，透過光線越弱 ， 產生的光電流就越小 ， 以至調節(jié)儀器的滿標有困難 。 靈敏度和穩(wěn)定性 提出了較高的要求 。 不同濃度標準溶液作參比時的 誤差曲線 某有色溶液以試劑空白作參比時，選用 cm吸收池，測得 T=%。 如果兩種組分的吸收曲線彼此不相干擾，可方便地選擇適當?shù)牟ㄩL進行測定，如果兩種組分地吸收曲線相互干擾時，則可用解聯(lián)立方程式的方法，求出各組分的含量。的時波長為值的時波長為值的時波長為值的時波長為其中????????????????y；x；y；x：lclcAlclcAyxyxyyxxyyxx221121————22112211???? B化合物溶液的濃度是 1 103 ，以蒸餾水為空白試驗時測得的吸光度為， B化合物的未知溶液在同樣條件下的吸光度為 。求兩種稀釋情況下濃度測定的相對誤差是多少？ 例 2 %%)1(43 lg43 %90%%%)1(43 lg43 %10%21??????????????????????TTTccTTTTccT解： 例 3 為測定含 A和 B兩種有色物質試液中 A和 B的濃度，先以 A物質作校正曲線， 求得 A在 ?1和 ?2時 ? A(?1) =4800 L?mol1?cm1和 ? A(?2) =700 L?mol1?cm1 ，再以純B物質作校正曲線，求得 ? B(?1) =800 L?mol1?cm1和 ? B(?2) =4200 L?mol1?cm1 ；對試液進行測定，得 A ?1 = A ?2 = 。 Lm olcLm olccccclclcAlclcAlcABABABABbAABbAA/1048 /1093 :142 00170 180 0148 0058 :45)2()2(2)1()1(1???????????????????????求得即得由???????????解： 作業(yè)： P214P215習題： 8 小結： 1. LB定律基本原理及計算 2. 分光光度計結構 3. 顯色反應與顯色條件選擇 4. 吸光度測量條件選擇 5. 光度計測量誤差計算 6. 高含量組分測定 —示差分光光度法