【正文】 純）磷酸85%（分析純)無水乙醇99%（分析純）丙烯酰胺≥95%（分析純）亞甲基雙丙烯酰胺≥%Tris%（分析純）DSD10%過硫酸銨≥%TrisHCl甘油≥95%（分析純）β巰基乙醇≥95%（分析純）溴酚藍%考馬斯亮藍R250≥95%（分析純）甲醇50%附表21續(xù)表藥品名稱純度枯草芽孢桿菌實驗室提供磷酸二氫鉀≥%（分析純）磷酸85%（分析純) 試驗儀器表22 實驗所用儀器儀器名稱型號/規(guī)格數(shù)顯恒溫水浴鍋HH1高壓滅菌鍋YXQSG46280S低速離心機802B恒溫磁力攪拌器852燒杯1000ml，500ml，50ml電子天平FA1004N移液管1mlpH計PHS3C電泳槽DYY12電泳儀DYY12容量瓶25ml，100ml分光光度計722比色管50ml 工藝流程 濾渣(棄去)蛋殼 雜蛋白(棄去) 濾液 上層清液(棄去) 上層清液 吸附物 濾渣(棄去) 濾液(棄去) 上層清液 結(jié)晶物 鑒定 測定酶活力 實驗過程 溶菌酶的提取蛋殼的預(yù)處理：將新鮮蛋殼用自來水進行沖洗，洗去殘余的蛋清和蛋殼表面的污垢，然后再用蒸餾水漂洗一遍，漂洗后的蛋殼濾干水分后置于干燥處10h，使蛋殼中的水分蒸發(fā)。L1的HCl調(diào)pH值，然后每10分鐘測一次pH值并且調(diào)整，在水浴鍋中加熱4h，在這過程中不停的攪拌并且調(diào)整pH值，始終讓溶液中的pH值保持不變，然后用篩子將蛋殼過濾掉[11]。除雜蛋白：將水浴鍋的溫度調(diào)到80℃，將燒杯溶液的pH值用1:，迅速放入水浴鍋攪拌加熱，不停的攪拌，當溫度到達77℃時發(fā)現(xiàn)有白色沉淀析出，開始計時，10分鐘后取出燒杯靜置。繼續(xù)靜置14個小時后，采用常壓過濾法過濾。清液留待進行下步實驗[12]。解離：將前一步得到的溶菌酶聚丙烯酸凝聚物， mol/Ll的Na2C03將其溶解，轉(zhuǎn)移后。 鹽折將所得澄清溶液加入5％的NaCI溶液攪拌均勻，放入冰箱調(diào)溫度為0℃。用無水乙醇洗滌數(shù)次。 溶菌酶的的鑒定配置鑒定試劑：30%凝膠貯備液：丙烯酰胺 ，亞甲基雙丙烯酰胺 ，加蒸餾水至100ml。4℃冰箱保存濃縮膠緩沖液（）: Tris ,加蒸餾水溶解，6mol/L，定容100ml。4℃冰箱保存10%SDS，室溫保存10%過硫酸銨：10g過硫酸銨，加蒸餾水定容至100ml（新鮮配置）上樣緩沖液：，甘油2ml，10%SDS 2ml，β巰基乙醇 1ml，%溴酚藍 ，加蒸餾水定容至10ml%考馬斯亮藍R250染色液：，加入91ml50% 甲醇，9ml 冰醋酸脫色液：50ml 甲醇，75ml 冰醋酸與875ml蒸餾水混合未知分子量的蛋白質(zhì)樣品裝板：將密封的硅膠框放在平玻璃上，然后將凹型玻璃與平玻璃重疊，將兩塊玻璃立起來使底端接觸桌面，用手將兩塊玻璃夾住放入電泳槽內(nèi)，然后插入斜插板到適中程度，即可灌膠。將膠液加到距短玻璃板上沿2cm處為止，約5ml。室溫放置聚合3040min。 蛋白質(zhì)樣品的處理：若標準蛋白質(zhì)或預(yù)分離的蛋白質(zhì)樣品是固體，加入1520μL的樣品處理液。吸取未知分子量的蛋白質(zhì)樣品20μL，按照標準蛋白質(zhì)的處理方法進行處理。加樣時用加樣器斜靠在提手邊緣的凹槽內(nèi)，以準確定位加樣位置[14]。當溴酚藍指示劑遷移到距前沿1~2cm處即停止電泳，約1~2小時。棄去染色液，用蒸餾水把膠面漂洗幾次，然后加入脫色液，進行擴散脫色，經(jīng)常更換脫色液，直至蛋白質(zhì)帶清晰，最后測出蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。按照枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基配方說明分別配制60ml固體培養(yǎng)基和30ml液體培養(yǎng)基，同時準備20個培養(yǎng)皿，一起于121℃、：待固體培養(yǎng)基溫度降至50℃左右時，在無菌操作臺內(nèi)倒平板，凝固后，將這20個培養(yǎng)皿分為兩組，放于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。溶菌酶抑菌試驗：先將已擴增好的菌液用經(jīng)滅菌的液體培養(yǎng)基按10101010106依次進行倍比稀釋，取稀釋好的菌液與50u l預(yù)先稀釋好的已過濾除菌的濃度為5mg/ml的溶菌酶溶液混合，然后將其倒入固體培養(yǎng)基進行涂布操作(固體培養(yǎng)基要提前于室溫中放置十分鐘)。整個操作要求在無菌環(huán)境中進行，已涂布好的固體培養(yǎng)基放于37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h，然后觀察試驗結(jié)果，并統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)[16]。底物懸浮液的制備：，加入5ml磷酸鹽緩沖液，在研缽中研磨3min，然后倒入50ml燒杯中，再加入磷酸鹽緩沖液，使總體積達到50ml。將其移至100ml量瓶中，加磷酸鹽緩沖液至刻度，搖勻。測定酶活力：取含枯草芽孢桿菌懸浮液作為底物．加入一定量的供試品溶液，于30℃450nm的波長下測定吸光度的變化．[17]。因此取第15 s和第75 s之間的差值，這樣便簡化了讀數(shù)范圍。提取溫度：室溫25℃；提取時NaCl含量：％表31 pH值對抽提的影響蛋殼pH溶酶菌50gpH不控制50g50g50g50g50g圖31 pH值對抽提的影響從表、pH不控制時溶菌酶的提取量最少。由圖可知，pH越大，對抽提越有利，溶菌酶從蛋殼中溶解出的量就會越多，．此外，在pH為3～，酶活變化較為顯著，溶菌酶穩(wěn)定性較差，因而溶菌酶雖然在酸性條件下耐熱性很好，但過酸也會影響溶菌酶的活性。另外，在抽提中所選擇的pH不應(yīng)超過酶的穩(wěn)定范圍，其次從最佳的抽提效果著眼，抽提時pH最好遠離待抽提酶的等電點，即酸性蛋白質(zhì)宜用堿性溶液抽提，堿性蛋白質(zhì)宜用酸性溶液。 溫度的影響，分別在25℃(室溫)、30℃、35℃、40℃、45℃中進行抽提。圖34 溫度對溶菌酶活性的影響由圖34可知，隨著溫度的提高。40℃以后，隨著溫度進一步升高，酶蛋白變性，酶活性則開始下降。 NaCl濃度的影響％NaCl、1％NaCl、％NaCl 、2％NaCl、％NaCl五種濃度進行平行實驗。 不同的NaCl濃度對酶活的影響圖36不同的NaCl濃度對溶菌酶活性的影響從圖36可以看出，抽提劑質(zhì)量分數(shù)為2％時溶菌酶活力最大，隨著抽提劑質(zhì)量分數(shù)的變大，溶菌酶酶活變大，且其變化曲線明顯。如果從溶解度角度考慮，鹽溶液的質(zhì)量分數(shù)加大，溶解度也會變大，因而鹽溶液質(zhì)量分數(shù)提高，溶菌酶活性應(yīng)隨之增強。 鹽析時pH值對溶菌酶活性的影響這五組實驗的條件是：抽提用NaCl溶液濃度2％．溫度40℃，鹽析用NaCl溶液濃度為5％。所以在較低的鹽濃度下，溶液的pH值接近等電時，析出的溶菌酶活性較好。未加溶酶的培養(yǎng)基上菌落生長較大，而含有溶菌酶的培養(yǎng)基上的菌落非常小，并且分布比較分散，這說明雞蛋溶菌酶嚴重影響到枯草芽孢桿菌的生長，對其生長有明顯的抑制作用。計算酶活力：△E450＝；Ew=；△ E450/(Ew)=()=15220U/mg所以測得溶菌酶的最高酶活力為15220U/mg。得出以下幾個結(jié)論：(1) 。本實驗的成功完成，對于環(huán)境保護和廢棄資源再利用有著重要的意義，我國作為一個產(chǎn)蛋大國，每天產(chǎn)生的廢棄蛋殼重量以千噸計，成批拋棄的蛋殼很快就會腐敗變質(zhì)，造成環(huán)境的污染，與其我們不遺余力地尋求解決垃圾污染、破壞環(huán)境的方法，還不如做到垃圾的減量化、資源化，這才是最具積極意義的，最值得提倡的。而發(fā)展現(xiàn)代蛋制品工業(yè)將會在很大的程度上改變這一現(xiàn)狀，所以對蛋殼的開發(fā)和資源化研究具有重要的理論和實踐意義。在此希望我的母校越來越好，老師們身體健康，生活順利。唯一的遺憾是我自己不夠主動，錯過了許多與您交流的機會。最后，再次感謝為了我們默默地無私的奉獻著自己的老師們，老師，您幸苦了！衷心祝愿母校的明天更加美好！