【正文】 氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH至溶菌酶的等電點(diǎn)區(qū)(～)，再加入溶菌酶晶體，在低溫下靜置2—3周時(shí)間，溶菌酶晶體即可析出，而其他蛋清中大部分蛋白質(zhì)仍在溶液中。蔣冶良（1997)利用超濾技術(shù)制備溶菌酶，冷凍干燥得到的溶菌酶質(zhì)量達(dá)到藥用標(biāo)準(zhǔn)（活力4000U/mg)。自20世紀(jì)50年代以后，隨著實(shí)驗(yàn)工具的飛速發(fā)展， 對(duì)雞蛋清溶菌酶和許多動(dòng)物溶菌酶的研究也更加確切，例如對(duì)溶菌酶的結(jié)構(gòu)、氨基酸排列等有了更淸楚的了解。 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)最早有關(guān)溶菌酶的報(bào)道的是1907年NicoHe首次發(fā)表桔草芽胞桿菌(Bacillus．subtitis)溶解因子存在；1909年拉希琴科指出，雞蛋清具有強(qiáng)抑菌作用。魚(yú)糕、糕點(diǎn)、酒類(lèi)、新鮮水產(chǎn)品等也可用溶菌酶來(lái)防腐。目前日本已有含溶菌酶的牙膏生產(chǎn)[2]。 ~，分子量約14000道爾頓。lysozyme。wasteby spectrophotometry,study討論了pH值、溫度、NaCl溶液濃度等因索對(duì)抽提鹽析及溶菌酶酶活力的影響，確定了最佳的抽提條件：，最佳抽提溫度為40℃，％，最佳鹽析pH為11；實(shí)驗(yàn)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)的方法對(duì)溶菌酶進(jìn)行鑒定，研究了溶菌酶對(duì)枯燥芽孢桿菌的抑制作用，并用分光光度計(jì)測(cè)定了溶菌酶的的酶活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：，溶菌酶對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)具有抑制作用，在最佳的抽提條件下提取的溶菌酶酶活力最高，為15220U／mg。of fresh是一種專(zhuān)門(mén)用于微生物細(xì)胞壁的水解酶。（2）在食品工業(yè)中，若將溶菌酶加在鮮牛奶或奶粉中，可增強(qiáng)嬰兒的免疫力；溶菌酶具有殺菌防腐作用，作為一種無(wú)毒無(wú)害蛋白質(zhì)，還是一種安全性很髙的殺菌劑，應(yīng)用于食品工業(yè)中作為防腐劑延長(zhǎng)商品的貨架期。（3）在基因工程和細(xì)胞工程中，溶菌酶是一種必不可少的工具酶。1922年弗萊明發(fā)現(xiàn)人的鼻涕、唾液、眼淚也有強(qiáng)的抑菌作用，并將溶菌的因子命名為溶菌酶；同年他又報(bào)道了從雞蛋清中提取溶菌酶的方法，從此開(kāi)始了對(duì)溶菌酶這種具有殺菌作用的天然抗感染物質(zhì)的研究。Alderton (1945)及Cardon (1945)采用彭潤(rùn)土吸附溶菌酶，再用5%吡啶溶出得到溶菌酶。Chingchuan yang (1998)利用陰離子多糖分離溶菌酶?？筛鶕?jù)要求純度的不同，將析出的溶菌酶晶體過(guò)濾，然后再溶解，通過(guò)同樣的方法重結(jié)晶，以達(dá)到更高的純度。離子交換層析法是制備高純度的溶菌酶時(shí)，最常用的方法。分配色譜的固定相一般為液相的溶劑。用螯合劑將特定的金屬離子固定在固體表面會(huì)減少蛋白質(zhì)一金屬相互反應(yīng)的自由度，蛋白質(zhì)因此不容易失活，可以保持較高的活性。聚乙二醇／葡聚糖和聚乙二醇／無(wú)機(jī)鹽是常用的雙水相體系，由于葡聚糖價(jià)格昂貴，因此聚乙二醇／無(wú)機(jī)鹽體系應(yīng)用更為廣泛。我國(guó)的廢棄蛋殼主要來(lái)源于大量消費(fèi)雞蛋的食品廠(chǎng)、孵化場(chǎng)、酒家等單位，而成批拋棄的蛋殼很快就會(huì)腐敗變質(zhì)，造成環(huán)境污染，在不遺余力地尋求解決垃圾污染、破壞環(huán)境的措施時(shí)，垃圾的減量化、資源化則是最具積極意義的，最值得提倡的。抽提：稱(chēng)取750g清洗干凈的蛋殼用900ml的一定濃度的NaCl溶液泡后，用2mol吸附：將過(guò)濾后的澄清溶液用20％，在調(diào)pH值的過(guò)程中不停的攪拌，有少量的乳白色沉淀析出，然后加入15％的聚丙烯酸，立即有白色沉淀析出．，靜置17個(gè)小時(shí)進(jìn)行傾析，得到粘附于底部的乳白色膠狀物。外包錫紙，4℃冰箱保存，30天內(nèi)使用分離膠緩沖液（）:Tris ,加蒸餾水溶解，6mol/L，定容100ml。待分離膠聚合后，用濾紙條輕輕吸去分離膠表面的水分，制備濃縮膠，用長(zhǎng)滴管小心加到分離膠的上面，插入樣品模子；待濃縮膠聚合后，小心把出樣品模子[14]。染色、脫色：電泳結(jié)束后，關(guān)掉電源，取出玻璃板，在長(zhǎng)短兩塊玻璃板下角空隙內(nèi)，用刀輕輕撬動(dòng)，即將膠面與一塊玻璃板分開(kāi)，然后輕輕將膠片托起，指示劑區(qū)帶中心插入銅絲作為標(biāo)志，放入大培養(yǎng)基中染色，%的考馬斯亮藍(lán)染液染色，過(guò)夜。 (2)溶菌酶酶活力的測(cè)定磷酸鹽緩沖溶液的配制：稱(chēng)取25g磷酸二氫鉀，倒入500ml燒杯中，加入20ml磷酸，待磷酸二氫鉀全溶后加入蒸餾水稀釋。第3章 結(jié)果與討論第3章 結(jié)果與討論 pH值的影響 pH值對(duì)抽提的影響以清洗后的蛋殼為原料用2mol/L1HCl維持抽提液pH，、。提取pH：,提取時(shí)Nacl含量：％表32 溫度對(duì)酶抽提的影響抽提溫度25℃30℃35℃40℃45℃溶菌酶的量圖33 溫度對(duì)酶抽提的影響℃時(shí)，酶的提取量最大，室溫時(shí)酶的提取量最少；溫度在40℃之前隨著溫度的升高提取量也隨之增大，溫度過(guò)40℃后提取量又有所減少。出現(xiàn)這種情況可能是因?yàn)槌樘崛芤褐械柠}離子能減弱溶菌酶分子間離子鍵及氫鍵的作用力，其鹽離子作用于大分子表面，增加了表面電荷，從而極性增加，水合作用增強(qiáng)，形成穩(wěn)定的雙電層[10]。 溶菌酶活力測(cè)定根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的數(shù)據(jù)可知，提取時(shí)的pH、溫度和氯化鈉的濃度不同時(shí)，溶菌酶的酶活力也不同，由表34可知，溫度40℃，氯化鈉濃度為2%時(shí)，溶菌酶酶活力最高。參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)[1] 徐立宏,[D].廣州：華南理工大學(xué)應(yīng)用化學(xué)系,2005,（5）：25~27.[2] 生吉萍,申琳,范蓓,姜馗,[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2003(z1)：334~337[3] [J].重慶工商大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2006,23(6) ：551~555[4] 姚福榮,羅樂(lè),向乾. 蛋殼中提取溶菌酶的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(35)：10977~10978[5] [J].食品科學(xué),2003,25(9)：119~121[6] [J].遼寧沈陽(yáng)：沈陽(yáng)化工學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院. ,22(3)：222~225[7] 趙玉萍,張灝,[J].食品科學(xué),2002(1)：58~54[8] 岳克,[D].內(nèi)蒙古石油化工,1997, 23(12):9~11[9] [D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2010[10] 鄒艷麗,孫溢,[J].生物工程學(xué) 報(bào),2005,21(3):520~525[11] 杜利成,楊葵華. 從雞蛋殼中提取溶菌酶的工藝研究[J]. 四川食品與發(fā)酵. 2005,41(2): 22~25[12] 劉楊,史清洪,趙黎明,[J] 控制學(xué)報(bào),2005,5(3):269~272[13] Nishiki T, Sato I,Muto A, et al. Mass transfer characterization in forward and back extractions of lysozyme by AOTisooctane reverse micelles across a flat liquidliquid interface[J]. Biochemical Engineering Journal, 1998,1(2):91~97[14] Noh KH, Imm JY. Onestep separation of lysozyme by reverse micelles formed by the cationic surfactant, cetyldimethylammonimn bromide[J]. Food Chemistry, 2005,93(1):95~101[15] 王煒軍,方穎,[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005,26(4):62~66[16] [J].廣州化工,2012,40(7)：53~56[17] 王煒軍,[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào),1996,17(5):59~63[18] 劉秋葉,蓋青青,何錫文,[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào),2008,29(3):505~509[19] 李德海,[J].中國(guó)乳品工業(yè),2002,30(5)：128~129致 謝經(jīng)過(guò)四個(gè)多月的努力終于完成了大學(xué)四年的里最后的一項(xiàng)任務(wù)，回首這四年里，付出了多少的努力和汗水，在這四年里我不斷的進(jìn)步，不斷的成長(zhǎng)，學(xué)會(huì)了很多，也懂得了很多，這是我人生中最重要的四年。衷心的感謝我的導(dǎo)師趙晴瀟老師對(duì)我關(guān)心、指導(dǎo)和教誨，在您的幫助和陪伴下度過(guò)了大學(xué)最后的一段時(shí)光，您開(kāi)闊的思維、敏銳的洞察力以及詳細(xì)的修改意見(jiàn)一直給我很大的啟發(fā)。表34 不同條件下的酶活力pH溫度NaCl濃度△E450酶活力25℃%1187025℃%1262025℃%1384025℃