分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)操作-閱讀頁
2025-01-28 07:33本頁面
【正文】 性：標(biāo)本制備 — PCR擴(kuò)增 — 產(chǎn)物分析 — 產(chǎn)物處理。 PCR體系及相關(guān)參數(shù)的設(shè)置 10 PCR buffer 5μl dNTP Mix(各 mM) 4μl 引物 P1（ 10 mM） 1μl 引物 P2（ 10 mM） 1μl 模板 * X μl 酶（ 5U/μl） 滅菌雙蒸水 up to 50μl 50μl標(biāo)準(zhǔn) PCR反應(yīng)體系 PCR體系及相關(guān)參數(shù)的設(shè)置 50微升標(biāo)準(zhǔn) PCR反應(yīng)體系中模板推薦使用量 人基因組 DNA μg 大腸桿菌基因組 DNA 10100 ng 質(zhì)粒 DNA ng 模板使用量 一般模板復(fù)雜程度越高，所需模板量越多，合適的模板量需要摸索 條件 PCR相關(guān)參數(shù)的設(shè)置 (1) 預(yù)變性 一般 94℃ 5分鐘； (2) 引物退火 根據(jù)所設(shè)計(jì)的引物來決定，一般為 5570℃ ； (3) 引物延伸 一般在 72℃ 進(jìn)行，延伸時(shí)間視擴(kuò)增片段長短而定，一般 1Kb需延伸 1min； (4) 循環(huán)中的變性 94℃ ， 30秒足以使各種靶 DNA序列完全變性； (5) 循環(huán)數(shù) 大多數(shù) PCR過程含 2535個(gè)循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增； (6) 最后延伸 在最后一個(gè)循環(huán)后，一般設(shè)置一個(gè) 72℃ ， 515min的延伸步驟，使引物延伸 完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。 （ 1）引物退火溫度 退火溫度是 PCR實(shí)驗(yàn)的一個(gè)重要參數(shù)，對 PCR的特異性有很大影響。最佳的引物濃度一般在 ，較高的引 物濃度會(huì)導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增； PCR體系的優(yōu)化 （ 3）鎂離子濃度 可以從 1mM到 3mM，以 ，進(jìn)行鎂離子濃度梯度實(shí)驗(yàn)； （ 4）循環(huán)參數(shù) 在 PCR的前 510個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)緊的退火溫度，使 特異性產(chǎn)物得到優(yōu)先擴(kuò) 增，然后在一個(gè)較低的退火溫度下反應(yīng) 2030個(gè)循 環(huán)；也可以使 PCR反應(yīng)在 一個(gè)高的退火溫度下開始，然后每個(gè)循環(huán)降低 ℃ 到 2℃ ，直到退火溫度低 于引物設(shè)計(jì)溫度 5℃ ； PCR體系的優(yōu)化 （ 5）熱啟動(dòng) 冰上配制 PCR反應(yīng)液，將其置于預(yù)熱的 PCR儀上開始反應(yīng)；另外還可利用具 有 熱啟動(dòng)功能的 DNA聚合酶來實(shí)現(xiàn)熱啟動(dòng)； （ 6）巢式 PCR 對于一些較難擴(kuò)增的模板，可以進(jìn)行巢式 PCR擴(kuò)增，以提高特異性和靈敏度。 PCR體系的優(yōu)化 （ 7）其他 對某些結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的模板，包括高 GC含量的模板，需要添加一些促進(jìn)劑以獲 得特異性的 PCR產(chǎn)物，如甲酰胺， DMSO，甘油，甜菜堿等可以增強(qiáng) PCR的擴(kuò)增。 此外有市場化的 GC rich 的 buffer，效果不錯(cuò) 一般都采用瓊脂糖凝膠電泳對 PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，初步判斷產(chǎn)物的特異性。如果產(chǎn)物特異性 好， 5微升檢測能看見清晰的帶，可以直接將產(chǎn)物送測序，否則必須割膠回收。 PCR實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng) 3 克隆 原理 普通 DNA聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，通常能在 PCR產(chǎn)物的 3‘端加上 A尾 單核苷酸，從而實(shí)現(xiàn) PCR片斷與一個(gè)具有 3‘T突出末端的載體連接； 限制性內(nèi)切酶可識別 DNA序列的特定位點(diǎn)并切割 DNA產(chǎn)生粘性末端，酶切 后的 DNA片段經(jīng)純化處理后可以與具有相同粘性末端的載體相連接。 克隆步驟 載體和目的片段的酶切 （ 1）限制性內(nèi)切酶反應(yīng)在滅菌的 PCR管中進(jìn)行， 20μl體積反應(yīng)體系如下： DNA μg 10 酶切 buffer μl 酶 12 U 加 ddH2O 至 20 μl 最適酶活溫度，酶切 23小時(shí)，割膠回收目的片段。通常 1μg量的 DNA加入 CIAP， 37℃ 處理 30min， 70℃ 滅活 10min，可以防止載體自連。如果目的片段較大，連 接則需要較長時(shí)間；酶切產(chǎn)生平端，應(yīng)該過夜連接；有些酶雖然酶切產(chǎn)生粘 端，但比一般的粘末端連接效率要低得多，也應(yīng)該過夜連接，如 NdeI, XhoI。將 克隆過程中未經(jīng)測序簽定及測序結(jié)果不對的質(zhì)粒及時(shí)丟棄，做好質(zhì)粒樣本貯 存登記、克隆的具體實(shí)驗(yàn)記錄、 DNA質(zhì)量鑒定記錄等，并由專人統(tǒng)一保管。
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