分子生物學基本實驗操作(已修改)
2025-01-25 07:33 本頁面
【正文】 分子生物學基本實驗操作 周正峰 克 隆 操 作 HEADLINE PCR 技術(shù) 實驗中一些好的習慣 1 2 3 4 核 酸 抽 提 1 核酸抽提 總 RNA抽提 原理 利用強變性劑異硫氰酸胍迅速裂解組織（或細胞），促 使核蛋白與核酸的解離，并迅速抑制細胞內(nèi)的 RNA 酶；經(jīng) 酸性苯酚 氯仿抽提，異丙醇沉淀可獲得完整的 RNA。 相關(guān)器皿的處理 塑料制品的處理 已經(jīng)標明 RNaseFree的塑料制品，如果沒有開封使用過，可以直接使用。對于國產(chǎn) 塑料制品，都必須處理方可使用，步驟如下： 1）在玻璃燒杯中注入雙蒸水，加入 DEPC使其終濃度為 %，磁力攪拌 ； 2）用 1）浸泡需要處理的塑料制品，在通風櫥中處理過夜； 3）棄將 DEPC水，用鋁箔封住處理過的塑料制品，高溫高壓滅菌至少 30 min； 5） 100℃ 烤至干燥，置于干凈處備用。槍頭必須在無菌操作臺中，用鑷子裝入槍頭 盒。 玻璃和金屬制品的處理 用去離子清洗干凈，用錫箔紙包好，然后至烘箱中 250℃ 烘烤 3小時以上 或者 180℃ 烘烤 8小時以上。 電泳槽的處理 用于 RNA電泳的電泳槽應用去污劑洗干凈，再用水沖洗，用乙醇干燥，然后灌滿 3%的 H2O2溶液，于室溫放置 10 分鐘，最后用 %DEPC水徹底沖洗電泳槽。 其他 RNA酶很難被滅活，實驗過程中要時刻注意防止 RNA酶污染。 實驗操作者的手也是 RNA酶最主要的潛在污染源之一，因此，在實驗準備和 RNA抽提過程中，都應戴手套，并盡可能勤換手套。 實驗室 RNA相關(guān)實驗用的儀器及試劑應該專用，包括移液器、玻璃器皿、塑料制 品和電泳槽等，并存放在指定地點。 總 RNA抽提步驟 勻 漿 相 分 離 溶 解 沉 淀 洗 滌 質(zhì) 量 檢 測 勻漿 勻漿 米粒大小的組織加入 100微升 Trizol ，冰上充分研磨至看不見塊狀的 組織，再補加 900ul Trizol 至 1ml（適用肝、腎等組織） 懸浮細胞 貼壁細胞 細胞 液 氮 研磨棒 組織 傾去培養(yǎng)基，按 10cm dish /ml的比例直接將 Trizol加入到培養(yǎng)皿中消化、裂解細胞，用 RNAse free的槍頭吹打數(shù)次，將樣品轉(zhuǎn)入無 RNA酶的 EP管中 用液氮預冷研缽，將綠豆大小的組織直接置于液氮中敲碎，并迅速研磨至 粉末狀，小心轉(zhuǎn)移至 1ml Trizol中。在研磨的過程中，應不斷補加液氮， 直至樣品成粉末狀（適用于心、胃、主動脈等組織） 4℃ 2 000g 離心 5分鐘收集細胞，用 Trizol重懸、裂解，每 1ml Trizol可裂解 510*106個細胞 相分離 （ 1）勻漿好的組織，室溫下靜置 510 min以充分裂解， 4℃ 、 16000rpm離心 10min， 取 800微升上清液轉(zhuǎn)入一個無 RNA酶的 EP管中；若為細胞樣本，可以省略此步， 直接進行下一步操作； （ 2）按照 1ml Trizol加入 200181。l氯仿，用手劇烈振蕩混勻 1530S后室溫靜置 1015 min， 直至出現(xiàn)較為明顯的分層； （ 3） 4℃ ， 16000 r/min離心 15 min，小心吸取上層水相于一新管。 *千萬不可吸取到中間界面，一般吸取 300微升上清，所得 RNA產(chǎn)量足以進行一般的 后續(xù)實驗，過多上清很容易造成 DNA污染； RNA沉淀 (4) 加入等體積異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置 10 min； (5) 4℃ ， 12022 rpm離心 10min，棄上清，此時可見 RNA沉淀于管底。在離心之前， RNA沉淀是不可見的，常常在離心管的邊緣或者底部形成凝膠狀小球； （ 6） 加入 1ml 75%DEPC乙醇，懸浮沉淀； * 此步一定要將 RNA沉淀懸浮起來，才能保證殘留的鹽被洗去 （ 7） 4℃ ， 12022 rpm離心 5 min，棄上清，室溫晾干，或者真空干燥 5~10 min，視 沉淀量的多少加入 DEPC ddH2O溶解 RNA，可用槍吹打數(shù)下以助 RNA溶解； * 沉淀不要過于干燥，否則將會大大降低 RNA的溶解度； RNA 洗滌、溶解 RNA質(zhì)量檢測 （ 1）完整性：可以用普通瓊脂糖凝膠電泳分析 RNA的質(zhì)量。電泳所用的緩沖液 必須是新配置的。如果電泳可見 28S和 18S兩條主要條帶，以及 5S的帶，并且 28S的亮度在 18S的兩倍以上，認為 RNA的質(zhì)量很好。 * RNA上樣量應控制在 300400ng左右，過多或過少都影響電泳效果 RNA質(zhì)量檢測 （ 2）純度和產(chǎn)量分析：計算 A260/A280的比值 R來判定 RNA的純度： 用 DEPC ddH2O溶解 RNA， R，認為
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