【正文】 第十二章 分子生物學(xué)研究方法 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 2 SNP概述 單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphism, SNP)：單個核苷酸的突變而引起的多態(tài)性。 單體型 (Haplotype)：染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的 SNP等位位點(diǎn)被稱作單體型。相鄰 SNPs的等位位點(diǎn)傾向于以一個整體信息傳遞給后代。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 3 SNP分類： ? 基因編碼區(qū) SNP(cSNP)： ? 同義 cSNP： SNP導(dǎo)致的編碼序列改變并不影響蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基和未突變堿基含義相同。 ? 非同義 cSNP：堿基改變使蛋白質(zhì)序列發(fā)生變化，從而影響蛋白質(zhì)的功能。常是生物性狀發(fā)生改變的直接原因。 ? 基因調(diào)控區(qū) SNP(pSNP)：影響基因表達(dá)量的多少。 ? 基因間隨機(jī)非編碼區(qū) (rSNP)： ? cSNP、 pSNP在功能和疾病發(fā)生、發(fā)展方面具有更重要的意義。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 4 SNP檢測技術(shù) 基因芯片、 Taqman技術(shù)、分子信標(biāo)、焦磷酸測序。 Taqman技術(shù)原理： ? 探針設(shè)計上，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)換 (FRET)技術(shù)，探針539。和 339。端分別用特殊的染料標(biāo)記，稱為 供體 受體 染料對或引爆 猝滅染料對。 ? 正常情況下，由于探針 539。端熒光基團(tuán)和 339。端猝滅基團(tuán)緊鄰在一起，供體所發(fā)熒光由于其光譜在空間上接近受體染料而被猝滅，只有當(dāng)兩者分離時才能檢測到供體所發(fā)出的熒光。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 5 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 6 ?Taqman技術(shù)的基本原理是利用 Taq酶的 539。核酸外切酶活性， PCR反應(yīng)中除了兩個傳統(tǒng)的 PCR引物 PP2外，還有第三個引物 P3(等位特異性 Taqman探針 )，含有待檢測的 SNP位點(diǎn)，特異結(jié)合在 P1結(jié)合位點(diǎn)的下游。 P3探針的 539。端和 339。端分別標(biāo)有熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)，因 P3的 339。端被猝滅基團(tuán)封阻而不能以自身為引物進(jìn)行擴(kuò)增。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 7 ?PCR反應(yīng)中， Taq酶以 P1為引物合成新的 DNA鏈，隨著反應(yīng)的進(jìn)行， Taq酶接觸到 P3并激發(fā)其5→3 外切酶活性，使 P3從 5端開始降解，最后DNA鏈得以延伸，而 P3探針上的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)由于不再在一個分子上，熒光基團(tuán)釋放而發(fā)出熒光信號。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 8 焦磷酸測序法： ? 核心：由四種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)反應(yīng)。 ? 四種酶： DNA聚合酶 (DNA poly merase)、 ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)、熒光素酶 (luciferase)、雙磷酸酶 (apyrase)。 ? 底物： 5’磷酰硫酸 (adenosine 5’phosphosulfate, APS)、熒光素 (luciferin)。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 9 ? 每輪測序反應(yīng)中，只加入 一種 dNTP，如果該 dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的 焦磷酸 基團(tuán) (PPi)，PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號，并由 PyrogramTM轉(zhuǎn)化為一個峰值，每個峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比，然后加入下一種 dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 10 ? 第一步： 1個特異性的測序引物和單鏈 DNA模板結(jié)合，然后加入酶混合物 (DNA Polymerase、 ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶 )和底物混合物 (5’磷酰硫酸 APS和熒光素 Luciferin)。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 11 ? 第二步：向反應(yīng)體系中加入1種 dNTP，如果它剛好能和DNA模板的下一個堿基配對，則會在 DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的 339。末端，同時釋放出一個分子的焦磷酸 (PPi)。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 12 ? 第三步：在 ATP硫酸化酶作用下，生成的 PPi與 APS結(jié)合形成 ATP。在熒光素酶催化下，生成的 ATP又與熒光素結(jié)合形成 氧化熒光素 ，同時產(chǎn)生可見光。通過 CCD光學(xué)系統(tǒng)即可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 13 ? 第四步：反應(yīng)體系中剩余的 dNTP和殘留的少量 ATP在雙磷酸酶的作用下發(fā)生降解。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 14 ? 第五步：加入另一種 dNTP，使第 2－ 4步反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的 DNA序列信息。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 15 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 16 SNP應(yīng)用 人類基因單體型圖的繪制。 SNP與疾病易感基因的相關(guān)性分析。 指導(dǎo)用藥與藥物設(shè)計。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 17 cDNA差示分析法克隆基因 —— RDA 代表性差異分析 (