動(dòng)物細(xì)胞制藥ppt課件-閱讀頁(yè)
2025-01-23 04:24本頁(yè)面
【正文】 新鮮培養(yǎng)基不斷加入反應(yīng)器，另一方面又將反應(yīng)液連續(xù)不斷地取出，但細(xì)胞留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞處于一種不斷的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。通過(guò)調(diào)節(jié)灌注速率可以把培養(yǎng)過(guò)程保持在穩(wěn)定的、廢物代謝低于抑制水平的狀態(tài)下。 灌注培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn) 細(xì)胞所處環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)條件較好，有害代謝廢物濃度低； 明顯提高細(xì)胞密度，從而提高產(chǎn)物表達(dá)量； 產(chǎn)物在反應(yīng)器中停留時(shí)間短，防止變性損失； 培養(yǎng)基的比消耗率降低，生產(chǎn)成本明顯降低。但使用血清的主要弊端是存在潛在的污染源、不同批號(hào)蛋白含量差異大及價(jià)格高等，給生物制品的生產(chǎn)造成了不利。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只要在培養(yǎng)基中增加某些適于細(xì)胞生長(zhǎng)的成分，如 纖連蛋白 、轉(zhuǎn)鐵蛋白 、 胰島素和表皮生長(zhǎng)因子 等，不少細(xì)胞即能在無(wú)血清供應(yīng)的情況下生長(zhǎng)，尤其是 CHO、雜交瘤及重組骨髓瘤細(xì)胞等。 CHO細(xì)胞能在僅含重組人胰島素一種蛋白成分的無(wú)血清培養(yǎng)基中連續(xù)傳代。某些細(xì)胞在無(wú)血清的條件下，其生長(zhǎng)和抗體的產(chǎn)量甚至較有血清培養(yǎng)時(shí)高出數(shù)倍。 高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)特性 正常的哺乳類動(dòng)物細(xì)胞具有下列四大生物學(xué)特征： 錨地依賴性： 細(xì)胞必須附在固體上或固定的表面才能生長(zhǎng)分裂 血清依賴性： 細(xì)胞必須具有生長(zhǎng)因子才能生長(zhǎng) 接觸抑制性： 細(xì)胞與細(xì)胞接觸后，生長(zhǎng)便受到抑制 形態(tài)依賴性： 細(xì)胞稱扁平狀，并有長(zhǎng)纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 上述特征使得正常的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體外培養(yǎng)中，一般只能存活 50代且在培養(yǎng)皿上以平面的形式生長(zhǎng)，即單層細(xì)胞生長(zhǎng)。 高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的條件 細(xì)胞系特征 喪失細(xì)胞接觸抑制性和錨地依賴性特征， 遺傳穩(wěn)定性 外源基因多次傳代后不至于丟失，易于長(zhǎng)期保存 合適的標(biāo)記 便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持 生長(zhǎng)快且齊 分裂周期短，生長(zhǎng)均一，便于控制 便于大規(guī)模培養(yǎng) 大多數(shù)正常的高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞并不能同時(shí)具備上述條件，癌細(xì)胞能滿足上述前四項(xiàng)要求，但在安全性能上有欠缺。 含有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（ HPRT）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞（ hprt ）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（ HAT培養(yǎng)基）生長(zhǎng)，載體上的標(biāo)記基因 hprt與之遺傳互補(bǔ)。如果在外源 DNA中摻入少量的受體細(xì)胞內(nèi)源性 DNA可以提高轉(zhuǎn)化效率。 電擊轉(zhuǎn)化法常用于對(duì)磷酸鈣共沉淀法無(wú)效的細(xì)胞類型，如生長(zhǎng)在懸浮液中的淋巴細(xì)胞等。 將這種脂質(zhì)體懸浮液加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，便會(huì)與受體細(xì)胞膜融合， DNA隨即進(jìn)入胞質(zhì)和核內(nèi)。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法 利用物理方法轉(zhuǎn)化高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的主要優(yōu)點(diǎn)是外源基因表達(dá)盒中不含任何病毒基因序列，這對(duì)外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化減輕了負(fù)擔(dān)。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法 以病毒 DNA為載體可以將外源基因直接轉(zhuǎn)染特定的受體細(xì)胞。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理 通過(guò)強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因 哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的基因擴(kuò)增現(xiàn)象 基因擴(kuò)增是外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高效穩(wěn)定表達(dá)的一種特殊方式。這些抗性細(xì)胞正是通過(guò)增加相關(guān)基因的拷貝數(shù)、提高關(guān)鍵代謝酶的表達(dá)水平，從而抵消氨甲喋呤的抑制效應(yīng)。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理 通過(guò)強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因 DHFRMTX高效表達(dá)系統(tǒng) 外源基因 dhfr 轉(zhuǎn)染 dhfr 細(xì)胞系 單克隆 mM MTX 培養(yǎng) 5 mM MTX mM MTX 外源基因擴(kuò)增 至 100拷貝 培養(yǎng) 單克隆 轉(zhuǎn)移 單克隆 單克隆 培養(yǎng) 培養(yǎng) 轉(zhuǎn)移 轉(zhuǎn)移 不含核苷 GSMSX高效表達(dá)系統(tǒng) 谷氨酰胺合成酶（ GS）能解除甲硫氨酸亞砜（ MSX）對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的毒害作用。 通過(guò)強(qiáng)化基因轉(zhuǎn)錄高效表達(dá)外源基因 Ap r M13 ori ColE1 ori CMVP Polylinker Gene Intron SV40 T PolyA signal 高效表達(dá)載體 mRNA前體 AAAAAAAAA mRNA 在載體上安裝病毒或細(xì)胞來(lái)源的強(qiáng)啟動(dòng)子以及有效的翻譯元件，也是使外源基因高效表達(dá)的一種手段，如： 細(xì)胞巨化病毒 CMV的啟動(dòng)子 動(dòng)物珠蛋白基因的內(nèi)含子 SV40的終止子和 polyA化信號(hào)序列 絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)型載體上攜帶內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，因?yàn)?mRNA前體的剪切能促進(jìn)成熟 mRNA向胞質(zhì)的運(yùn)輸，有利于翻譯。 利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體 Neor 鼠金屬硫蛋白啟動(dòng)子 b 肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子 抗體輕鏈 cDNA b 肌動(dòng)蛋白終止子 pL dhfr SV40啟動(dòng)子 b 肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子 抗體重鏈 cDNA b 肌動(dòng)蛋白終止子 pH 大多數(shù)惡性淋巴瘤細(xì)胞表面上都有一種特異性的糖蛋白 campath 用人源化的小鼠抗 campath抗體治療非霍金淋巴細(xì)胞瘤患者，效果良好。 利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人組織纖溶酶原激活劑 第一個(gè)由重組哺乳動(dòng)物 dhfr 啟動(dòng)子 人 tPA cDNA 終止子 細(xì)胞規(guī)?；a(chǎn)的醫(yī)用蛋白 是治療急性心肌梗塞的溶血 栓藥物：人組織纖溶酶原激 活劑（ tPA）。目前， 用該工藝路線生產(chǎn)的重組人 tPA已經(jīng)商品化。 利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人凝血因子 VIII 凝血因子 VIII編碼基因的缺陷與血友病密切相關(guān)。然而由于人的血源污染乙肝病毒或愛(ài)滋病病毒，數(shù)千名使用這種血液制品的血友病人慘遭感染，其中 10%的病人最終死于愛(ài)滋病而非血友病。與 tPA相似，人凝血因子 VIII也是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子，必須通過(guò)重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)，但目前商品化了的重組人凝血因子 VIII尚不能滿足幾代血友病人的大量需求。 動(dòng)物克隆技術(shù) Dolly 轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物技術(shù) Polly 以動(dòng)物體細(xì)胞（包括動(dòng)物成體體細(xì)胞、胎兒成纖維細(xì)胞等）為受體，將目的基因以 DNA轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入能進(jìn)行傳代培養(yǎng)的動(dòng)物體細(xì)胞，再以這些體細(xì)胞為核供體進(jìn)行動(dòng)物克隆 組織工程 應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理和方法，用少量組織細(xì)胞通過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增，構(gòu)建新的組織和器官，最終在人體實(shí)現(xiàn)無(wú)損傷修復(fù)和真正意義上的功能重建。 思考題 名詞解釋： 轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、微載體培養(yǎng) 簡(jiǎn)述動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)特
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1