【正文】 細(xì)胞破碎儀對發(fā)酵液進(jìn)行超聲處理 5 min，再經(jīng) 8000 r/min 離心分離 20 min，取得清液。 分析方法 初篩酶活測定方法 100μ L 發(fā)酵液 +100μ L (L 一亮氨酸對硝基苯胺LleupNA) ，點樣板，上蓋玻璃板， 30℃保溫 20min，根據(jù)黃色深淺粗略判斷酶活。 實驗結(jié)果與討論 高產(chǎn)菌種篩選 采用逐步遞進(jìn)的方式每層都選擇酶活最高的菌株，采用優(yōu)選策略。 7 測酶活方法 搖床轉(zhuǎn)速 200 轉(zhuǎn)，溫度 37℃， 搖床 48 小時，發(fā)酵液取出測 OD600， 然后調(diào) PH至 ，放 4℃ 冰箱 20 分鐘，然后冰浴超聲破碎：（ 30秒 超聲， 30 秒 間歇，共 5個循環(huán)，每次放冰箱 20 分鐘）。 對照組： 6ml 的 TrisHcl 緩沖液 + 去離子水 測定組： 6ml 的 TrisHcl 緩沖液 + 酶液 測定方法 40℃水浴預(yù)熱 5min，向 對照組 和 測定組 同時加 26mM LNA 乙醇溶液，準(zhǔn)確反應(yīng) 10min，立即于 405 nm 處比色。 本章小結(jié) 采用優(yōu)選的方式進(jìn)行篩選。 9 第四章 氨肽酶對呈味肽溶液的脫苦 材料與方法 材料與試劑 羅非魚下腳料（蛋白質(zhì)含量為 %~ %）：來自海南翔泰漁業(yè)有限公司；中性蛋白酶（ 610 4 U/g） ： 購 于 北京奧博星生物科技有限公司 ；巨大芽孢桿菌 L19：篩選于豆腐乳，經(jīng)鑒定，保藏于廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院；氨肽酶凍干粉：利用巨大芽孢桿菌 L19 發(fā)酵制備；其它試劑均為分析純，市售。 氨肽酶制劑的制備與活性分析 制備：發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20 g/L，葡萄糖 20 g/L，蛋白胨 10 g/L，牛肉膏 20 g/L，酪蛋白 10 g/L， KH2PO4 1 g/L， Na2HPO47H 2O g/L。 將巨大芽孢桿菌 L19斜面菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基，每瓶接 1環(huán)斜面菌種，置于 37 ℃ 、 200 r/min 的條件下振蕩培養(yǎng) 36 h；在冰水浴中，采用 200 w 超聲波細(xì)胞破碎儀對發(fā)酵液進(jìn)行超聲處理 5 min，再經(jīng) 8000 r/min 離心分離 20 min，取得清液，然后采用截留分子量為 5000 Da 的超濾膜進(jìn)行濃縮 3倍，取得濃縮液；將聚乙二醇作為保護(hù)劑加入濃縮液，加入量為 1 %，然后于 20 ℃ 預(yù)凍 12 h，再在 10 Pa~100 Pa 的條件下進(jìn)行冷凍干燥 32 h，制得氨肽酶的酶粉，測定酶活，備用。測定前，配制一系列對硝基胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液， 10 在 405 nm 波長下測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活力定義： 50 ℃ ，每分鐘分解 L亮氨酸對硝基苯胺產(chǎn)生 1 181。 pH 的優(yōu)選 分別將呈味肽濾液的 pH 值調(diào)節(jié)至 、 、 、 、 和 ，加入氨肽酶的酶粉，加酶量為每克底物（固形物）加入 10 4 U 氨肽酶，置于 60 ℃振蕩酶解 12 h。 溫度的優(yōu)選 根據(jù) 的結(jié)果，將呈味肽濾液的 pH 值調(diào)節(jié)至最適 pH，加入氨肽酶的酶粉，加酶量為每克底物（固形物）加入 10 4 U 氨肽酶，分別置 于 45 ℃ 、 50 ℃ 、55 ℃ 、 60 ℃ 、 65 ℃ 和 70 ℃ ，振蕩酶解 12 h。 酶用量與時間的優(yōu)選 將氨肽酶的加酶量分別調(diào)節(jié)為 10 4 U/g、 10 4 U/g、 10 4 U/g和 10 4 U/g，根據(jù) 和 的結(jié)果，在最適 pH 和最適溫度下進(jìn)行振蕩酶解 12 h。 苦味的感官評價及游離氨基酸的測定 參照文獻(xiàn)的方法 [2]，采用氨基酸自動分析儀測定樣品的游離氨基酸。L。分別配制 102 g/L、 103 g/L、 104 g/L、 105 g/L和 106 g/L 11 的硫酸奎寧溶液，對應(yīng)的苦味強度分別為：強、較強、中、弱、無。 總氮的測定采用微量 凱氏定氮法（按 測定） 。 實驗結(jié)果與討論 氨肽酶制劑的活性分析 將一系列濃度的對硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液在 405 nm 下測定吸光度，對硝基苯 胺溶液濃度與吸光值關(guān)系的曲線如圖 2所示。g/L。 00 40 80 20 60 00 40 80 20405nm的吸光度對硝基苯胺濃度 （ ? g/L ） 圖 2 對硝基苯胺濃度與吸光值關(guān)系的曲線 pH 對氨肽酶酶解的影響 pH 對氨肽酶酶解的影響 在不同 pH 下，呈味肽溶液酶解后的游離氨基酸濃度如圖 3 所示?？梢钥闯?，巨大芽孢桿菌 L19 所制備的氨肽酶屬于堿性蛋白酶，在堿性條件下具有良好的酶解能力。 12 3000350040004500500055006000游離氨基酸濃度（mg/L）pH 圖 3 pH 對氨肽酶酶解的影響 溫度對氨肽酶酶解的影響 在不同溫度下，呈味肽溶液酶解后的游離氨基酸濃度如圖 4所示。 45 50 55 60 65 703000350040004500500055006000游離氨基酸濃度（mg/L）溫度（ ? C ） 圖 4 溫度 對氨肽酶酶解的影響 酶用量與時間對氨肽酶酶解的影響 在 pH 、 60 ℃ 的條件下，不同用量氨肽酶在酶解過程中的變化曲線如圖5所示。在酶用量的實驗范圍內(nèi)，酶解前期的游離氨基酸濃度受到酶用量的影響較大，增大酶用量有利于提高游離氨基酸濃度；當(dāng) 氨肽酶的用量增大到一定水平以后，酶解后期的游離氨基酸濃度差距很小。從盡可能節(jié)省酶用量和時間的角度考慮， 104 U/g 和 10 h 分別被優(yōu)選為最佳的酶用量和時間，此條件下的游離氨基酸濃度達(dá)到 5970 mg/L。酶解前后游離氨基酸組成的對比如表 2所示。由表 2 可見，經(jīng)過氨肽酶酶解 10 h，呈味肽溶液中游離氨基酸的總量明顯增加，游離氨基酸增加的總量達(dá) mg/L；其中，甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸等疏水氨基酸的增加量較為明顯，疏水氨基酸的增加量約占 %，說明氨肽酶可以去除呈味肽的部分疏水氨基酸，有利于苦味的脫除。以羅非魚下腳料為原料，經(jīng)中性蛋白酶的酶解、超濾膜（ 360~2500 Da）過濾等步驟制備，得到氨肽酶酶解試驗所需的呈味肽溶液；采用氨肽酶粉劑對呈味肽溶液進(jìn)行酶解，分別確定最適的 pH、溫度、酶用量和時間為： pH 、 60 ℃ 、 104 U/g 和 10 h。巨大芽孢桿菌 L19 的氨肽酶具有開發(fā)價值，其產(chǎn)酶能力、產(chǎn)酶條件等仍需進(jìn)一步研究，以便更好地應(yīng)用于去除呈味肽的苦味。 2：結(jié)果表明，溫度、 pH、液固比及加酶量對堿性蛋白酶的酶解作用均有影響，堿性蛋白酶酶解制備呈味肽的最佳條件是：溫度 55℃ 、 、液固比 3:加酶量 800 U/g 和酶解時間 5h。本次試驗探索了羅非魚下腳料酶解制備呈味肽的工藝條件，可為羅非魚下腳料綜合利用提供有價值的參考。并確定了最適用條件 pH、溫度、酶用量和時間為： pH 、 60 ℃ 、 104 U/g 和 10 h。 展望：巨大芽孢桿菌 L19 的氨肽酶具有開發(fā)價值，其產(chǎn)酶能力、產(chǎn)酶條件等仍需進(jìn)一步研究，以便更好地應(yīng)用于去除呈味肽的苦味。