【正文】 的條件下，呈味肽溶液的游離氨基酸增量為 mg/L，疏水氨基酸的增加量占 %，苦味基本消失，表明氨肽酶具有良好的水解能力和脫苦能力。 本課題的研究目的與意義 本課題將以羅非魚下腳料為原料，利用酶解技術(shù)制備呈味肽，從而探索羅非魚下腳料綜合利用的有效 II 途徑。圖 2可以看出，溫度對(duì)堿性蛋白酶的酶解作用有很大的影響，兩個(gè)指標(biāo)均 3 因溫度不同而具有較大的差異， 堿性蛋白酶在 55℃ 時(shí)的水解率和短肽得率均為最高。 培養(yǎng)基配制 富集培養(yǎng)基 (g/L ) 可溶性淀粉 8,酵母膏 2,干酪素 I0, KH2PO4 1, MgSO4 將斜面菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基，每瓶接 1 環(huán)斜面菌種，置于 37 ℃ 、 200 r/min 的條件下振蕩培養(yǎng) 36 h；在冰水浴中，采用 200 w 超聲波細(xì)胞破碎儀對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行超聲處理 5 min，再經(jīng) 8000 r/min 離心分離 20 min，取得清液。7H 2O g/L。L。 45 50 55 60 65 703000350040004500500055006000游離氨基酸濃度（mg/L）溫度（ ? C ） 圖 4 溫度 對(duì)氨肽酶酶解的影響 酶用量與時(shí)間對(duì)氨肽酶酶解的影響 在 pH 、 60 ℃ 的條件下，不同用量氨肽酶在酶解過程中的變化曲線如圖5所示。本次試驗(yàn)探索了羅非魚下腳料酶解制備呈味肽的工藝條件，可為羅非魚下腳料綜合利用提供有價(jià)值的參考。巨大芽孢桿菌 L19 的氨肽酶具有開發(fā)價(jià)值，其產(chǎn)酶能力、產(chǎn)酶條件等仍需進(jìn)一步研究，以便更好地應(yīng)用于去除呈味肽的苦味?？梢钥闯?，巨大芽孢桿菌 L19 所制備的氨肽酶屬于堿性蛋白酶，在堿性條件下具有良好的酶解能力。 酶用量與時(shí)間的優(yōu)選 將氨肽酶的加酶量分別調(diào)節(jié)為 10 4 U/g、 10 4 U/g、 10 4 U/g和 10 4 U/g，根據(jù) 和 的結(jié)果，在最適 pH 和最適溫度下進(jìn)行振蕩酶解 12 h。 9 第四章 氨肽酶對(duì)呈味肽溶液的脫苦 材料與方法 材料與試劑 羅非魚下腳料（蛋白質(zhì)含量為 %~ %）：來自海南翔泰漁業(yè)有限公司；中性蛋白酶（ 610 4 U/g） ： 購 于 北京奧博星生物科技有限公司 ；巨大芽孢桿菌 L19：篩選于豆腐乳，經(jīng)鑒定，保藏于廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院；氨肽酶凍干粉：利用巨大芽孢桿菌 L19 發(fā)酵制備；其它試劑均為分析純，市售。 發(fā)酵：發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20 g/L，葡萄糖 20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏 20 g/L，酪蛋白 10 g/L， KH2PO4 1 g/L， Na2HPO4本次試驗(yàn)探索了羅非魚下腳料酶解制備呈味肽的工藝條件，可為羅非魚下腳料綜合利用提供有價(jià)值的參 考。 048121620木瓜蛋白酶 中性蛋白酶 胰蛋白酶 堿性蛋白酶水解率 / % 圖 1 不同蛋白酶對(duì)羅非魚下腳料的水解率 液固比的優(yōu)選 在 55℃ 、 、加酶量 800U/g 的條件下，采用 堿性蛋白酶對(duì)不同液固比的底物體系進(jìn)行酶解處理，酶解后的短肽得率如圖 4所示。 羅非魚下腳料綜合利用的現(xiàn)狀 羅非魚是聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦養(yǎng)殖的熱帶亞熱帶經(jīng)濟(jì)魚類 ，全球有 85 個(gè)國家和地區(qū)養(yǎng)殖羅非魚。 Aminopeptidase。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 蛋白酶的優(yōu)選 在各種蛋白酶的最適作用條件范圍內(nèi)，木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)羅非魚下腳料的水解率如圖 1 所示。 131517192123250 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10時(shí)間 / h短肽得率 / %6 0 0 U / g 8 0 0 U / g1 0 0 0 U / g 1 2 0 0 U / g 圖 5 不同加酶量對(duì)短肽得率的影響 本章小結(jié) 采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)羅非魚下腳料進(jìn)行酶解， 堿性蛋白酶的酶解能力最強(qiáng)。 初篩方法 將平板分離所得的菌接入裝有 5ml 初篩培養(yǎng)基的大試管內(nèi)， 37℃培養(yǎng)18h，初測(cè)酶活。 測(cè)氨肽酶酶活記錄 菌種 搖床前 PH 搖床后 PH 搖床前OD600 搖床后OD600 酶液 原 液OD405 酶液原液 的酶活U/mL 酶液稀釋十倍OD405 枯草芽孢桿菌 7 6 3.9563 — 巨大芽孢桿菌 7 4.6996 — L71811 7 3.6206 — L197 7 4.0042 — W7181 7 3.0451 — 菌種鑒定 經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌即代號(hào) L19 酶活較高故采取該菌株作為制取氨肽酶的菌種。酶解后，測(cè)定游離氨基酸的含量，根據(jù)游離氨基酸含量選擇適宜的酶解 pH。將制備的氨肽酶制品配制成適當(dāng)濃度的酶液，經(jīng)測(cè)定與計(jì)算，氨肽酶制品的酶活可確定為 104 U/mg。 表 1 呈味肽溶 液苦味強(qiáng)度的變化 時(shí)間（ h） 0 2 4 6 8 10 苦味強(qiáng)度 強(qiáng) 強(qiáng) 較強(qiáng) 中 弱 無 14 本章小結(jié) 巨大芽孢桿菌 L19 發(fā)酵制備的氨肽酶粉劑具有較高的活性，達(dá) 104 U/mg。在最適的條件下，呈味肽溶液的游離氨基酸增量為 mg/L，其中疏水氨基酸的增加量占 %，苦味基本消失，表明氨肽酶具有良好的水解能力和脫苦能 力。在酶解 10 h，酶用量 104 U/g 與酶用量 104 13 U/g、 104 U/g 的游離氨基酸濃度十分接近。感官分析時(shí)，如果待測(cè)樣液與某一濃度標(biāo)準(zhǔn)液苦味相近，即可把待測(cè)樣液的苦味強(qiáng)度確認(rèn)為該標(biāo)準(zhǔn)液的苦味強(qiáng)度。 活性分析：利用 TrisHC1 緩沖溶液 將氨肽酶制品配制成一定濃度的酶液，采用 LNA 法 [1]測(cè)定氨肽酶液的酶活。酶活高代表該菌種適用于復(fù)篩。 保藏培養(yǎng)基 (g/L ) 可溶性淀粉 2,蛋白胨 5，牛肉膏 2,酪蛋白 1，瓊脂 20 , 初篩培養(yǎng)基 (g/L ) 麥芽糖 5,蛋白胨 12，牛肉膏 2, KH2PO4 1, MgSO4圖 2可以看出，溫度對(duì)堿性蛋白 酶的酶解作用有很大的影響，兩個(gè)指標(biāo)均因溫度不同而具有較大的差異， 堿性蛋白酶在 55℃ 時(shí)的水解率和短肽得率均為最高。以及應(yīng)用氨肽酶對(duì)制得的呈味肽進(jìn)行脫苦的應(yīng)用。 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 畢業(yè)設(shè)計(jì) (論文 ) 題 目： 羅非魚制取呈味肽的研究 系（院） ：