【正文】 試劑的主要原材料、生產工藝及反應體系、產品質量控制等環(huán)節(jié)提出指導性技術要求。 本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。 本指導原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標準體系以及當前認知水平下制訂的，隨著法規(guī)和標準的不斷完善、科學技術的不斷發(fā)展，其相關內容也將進行適時的調整。其他酶聯(lián)免疫法檢測試劑（如作為二類管理的體外診斷試劑）可參考本指導原則執(zhí)行。 — 2— 術人員、儀器設備以及適宜的生產環(huán)境，獲得《醫(yī)療器械生產許可證》；同時，應按照《體外診斷試劑生產實施細則（試行）》的要求建立相應的質量管理體系，形成文件和記錄，加以實施并保持有效運行；還應通過《體外診斷試劑生產企業(yè)質量管理體系考核評定標準（試行）》的考核。 、規(guī)范的原則，各反應條件的選擇和確定應符合基本的科學原理。 ：保證試劑使用安全、質量穩(wěn)定、工藝可控、檢測有效。這類原料可用于包被酶標反應板、標記相關酶（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）、中和反應用抗原或抗體、制備校準品（標準品）等。主要生物原料若 為企業(yè)自己生產，其工藝必須相對穩(wěn)定；若購買，其供應商要求相對固定，不能隨意變更供應商，如果主要原料（包括工藝）或其供應商有變更，應依據國家相關法規(guī)的要求進行變更申請。 （ 2）純度和分子量 主要經 SDSPAGE 電泳后，利用電泳掃描儀進行分析，也可用其他適宜的方法，如高效液相法等。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量，純度應達到相應的質量標準，分子量大小應在正確的條帶位臵。 （ 4）效價 效價的測定一般根據蛋白含量 測定結果，通過倍比稀釋法進行。 （ 5）功能性實驗 功能性實驗是指生物原料用于試劑盒實際生產中的情況，一般考查使用該原料的試劑盒的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性等，并比較其與上批次原料的相關性。這些生物原料的質量標準應符合 2021年版的《中國生物制品主要原輔材料質控標準》規(guī)定的標準要求，并且要適合于本企業(yè)的生產。無菌試驗：將血清直接 37℃放臵 7 天，明亮處觀察，不得出現(xiàn)混濁或 — 4— 沉淀。 球蛋白含量：取待測血清 1ml，采用飽和硫酸銨法進行沉淀，沉淀溶于 %氯化鈉溶液，至 1ml，用 Lowry 方法測定，蛋白含量應≤2mg/ml。 溶解性：將 牛血清白蛋白配成 10%溶液，在 18 26℃時，溶解時間應≤ 15 分鐘， pH值應為 。 總蛋白中的牛血清白蛋白（ BSA）含量：采用硝酸纖維素膜電泳法，其標準為≥ 95%。（ 3）酪蛋白： 應符合生產所需的質量標準。 對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應進行功能性實驗，即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品，進行酶聯(lián)免疫測定，均不能出現(xiàn)非特異性反應。 3.化學原材料 化學原材料的質量標準，包括外觀、一般鹽類檢測、溶液 pH 值、溶解情況、干燥失重、熾灼殘渣等，均應符合《中國生物制品主要原輔材 — 5— 料質控標準（ 2021 年版）》分析純級別的要求，并且要適合于本企業(yè)的生產。化學原材料在購入時，原材料的生產商必須提供該批次化學原材料的質量保證材料和質量檢驗報告。②吸附能力和精密性采用合適的方法進行檢驗。 CV 值結果應符合相關產品的功能性質量標準，一般批內 CV≤ 5％，批間 CV≤ 10％。 （ 3）其他材料 包括試劑瓶標簽、粘膠紙、鋁箔袋、襯墊、可密封塑料袋、說明書、干燥劑和包裝外盒等，應參照國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā) 布的《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》和《醫(yī)療器械說明書、標簽和包裝標識管理規(guī)定》建立相應質量控制標準。如該產品具有國家標準品或參考品，應使用國家標準品（參考品）進行標化；若該診斷試劑沒有國家標準品（參考品），則企業(yè)參考品的制備應有規(guī)范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監(jiān)督管理局已經批準 的同類產品的質量。 （三）試劑盒各組分的生產 酶聯(lián)免疫法檢測試劑主要組分的生產包括酶標記物的制備及滴配過程（酶工作液濃度確定）、各種工作溶液的配制、包被酶標反應板、分裝及包裝等步驟；并通過產品的半成品檢驗和成品檢驗兩個質控過程來保證其質量符合規(guī)定。若陰性、陽性對照或其他液體組分涉及生物安全性問題，制備時應在相應的生物安全實驗室完成。對于定量檢測試劑，其標準品（或校準品）溶液應具有量值溯源性。 包被前應對酶標反應板進行質量檢驗，如尺寸、外觀、包裝、吸附性能、精密性等，并記錄酶標反應板的批號、數(shù)量、標識。不同批號的板條不能混用。 應對包被過程進行相應的質量控制，如包被用原料（抗原或者抗體等生物活性原料）的質量檢驗、包被液和封閉液的質控（如配方、外觀、 pH 值）、包被過程的監(jiān)控（包括包被和封閉的體積、溫度、時間等）、包被均一性檢驗、干燥過程的監(jiān)控等。 分裝及包裝均應按照相應的標準操作規(guī)程要求進行。 （四）質量控制 （ 1）半成品抽樣 檢驗人員按試劑的批號，根據抽樣申請單抽取規(guī)定數(shù)量的半成品各 — 8— 組分，作號標記、待檢。半成品檢驗，一般使用國家標準品（參考品）或經國家標準品（參考品）標化后的企業(yè)參考品。 檢驗指標一般包括陰 /陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性等，均應達到相應的質量標準要求。對定量檢測試劑，同時應分析其線性相關系數(shù)和定量質控品檢測結果的準確性。試劑盒各組分應留樣， 2 8℃定期作穩(wěn)定性考核，同時作 37℃熱穩(wěn)定性試驗，試驗結果應符合產品的質量標準。抽樣數(shù)量應包括檢驗用數(shù)量和留樣數(shù)量。 每一批酶聯(lián)免疫類檢測試劑的 試生產量應滿足工藝研究、分析性能驗證、穩(wěn)定性研究、臨床試驗、自測及注冊檢驗等各階段所需樣品量的要求。若該診斷試劑沒有國家 — 9— 標準品（參考品），則使用企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應有規(guī)范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監(jiān)督管理局已經批準的同類產品的質量。 四、名詞解釋 酶聯(lián)免疫法：是指在酶標板上包被特定的抗原（和 /或抗體）后，利用直接或間接的方法與待測樣品中的相關抗體（和 /或抗原）反應，形成的抗原抗體復合物再與相應的酶標記的抗體和 /或抗原進一步反應，經過酶催化底物發(fā)生顯色反應，由形成的顏色的強弱來判斷樣本中相應的抗體和 /或抗原的存在。 本指導原則系對核酸擴增法檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品特性確定其中的具體內容是否適用，若不適用，需詳細闡述其理由及相應的科學依據。應在遵循相關法規(guī)的前提下使用本指導原則。 二、適用范圍 本指導原則適用于核酸擴增法檢測試劑的注冊技術審查，其他類核酸檢測試劑可參照相關內容。研制、生產用的各種原料、輔料等應制定其相應的質量標準，并應符合有關法規(guī)的要求。建立專用實驗室，實驗室應當嚴格分區(qū)，人員和物品應當單向流動，以最大限度地防止實驗過程中樣品之間的污染和避免擴增產物的污染。 《體外診斷試劑生產實施細則（試行）》的要求，建立相應的質量管理體系，并應通過《體外診斷試劑生產企業(yè)質量管理體系考核評定標準（試行）》的考核。 ，應提供與通行原材料比對研究結果及相關資料。 （二）原材料 應提供主要原材料如引物、探針、企業(yè)參考品或標準品等的選擇與來源、制備過程、質量分析和質量標準等的相關研究資料。主要原材料（包括生產工藝）或其供應商發(fā)生變更，應依據國家相關法規(guī)的要求進行變更申請。 （ dNTP） 核酸的組成成分，包括： dATP、 dUTP、 dGTP、 dCTP和 dTTP。 — 20℃保存。 凍干粉，序列正確，合成量應達到試劑生產要求。應提供合成機構出具的合成產物的質 檢證明，如 PAGE電泳結果或 HPLC分析圖譜。以紫外分光光度計測定OD260nm/OD280nm的比值在 — 之間，可視為合格引物。 是指特定的帶有示蹤物（標記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。端 (和 /或 339。端標記熒光素淬滅 基團，并經 HPLC 或其他適宜方法純化。應提供合成機構出具的合成產物的質檢證明，如 HPLC 分析圖譜；應對探針的核酸序列及標記的熒光素或化學發(fā)光物進行核實，并作 HPLC 分析。另外，根據標記熒光素的不同，還應該在熒光素的激發(fā)波長處有吸收峰，如 FAM熒光素在 494nm、TET 熒光素在 521nm、 TAMRA 熒光素在 560nm 處有特異的吸收峰，雜交探針在 493nm、 625nm、 685nm 處有特異的吸收峰 ，檢定合格后入庫。 如 TaqDNA 聚合酶。 20℃保存。 20℃保存。 — 20℃保存。配制工作液的各種原材料及其配比應符合要求，原材料應混合均勻，配制過程應對電導率 pH、等關鍵參數(shù)進行有效控制。 （四）質量控制 （ 1）按批號抽取規(guī)定數(shù)量的半成品。如果產品具有國家標準品或參考品，應以其進行檢定。 （ 3）半成品檢定內容包括：陰 /陽性參考品符合率、靈敏度、特異性、精密度。 （ 4）半成品檢定合格后，按試劑盒組成及時進行分裝和包裝。 — 26— （ 2）產品完成包裝后，應根據生產量進行抽樣和生產記錄審核。結果應符合要求。 5．試劑批放行前，應對需要進行穩(wěn)定性考核的試劑成分，在特定溫度或條件下進行穩(wěn)定性試驗。 四、名詞解釋 核酸擴增法檢測試劑：核酸擴增技術泛指以擴增脫氧核糖核酸（ DNA）或核糖核酸（ RNA）為手段，檢測特定核酸序列或篩查特定基因的檢測技術，如聚合酶鏈反應（ PCR）、連接酶鏈反應（ LCR）、轉錄依賴的擴增反應（ TMA）等。 五、參考文獻 1.《中國生物制品規(guī)程》（ 2021年版），化學工業(yè)出版社 — 27— 第四篇：抗人球蛋白檢測試劑注冊技術審查指導原則（ 2021 年） 附件 3 抗人球蛋白檢測試劑注冊技術審查指導原則 本指導原則旨在指導注冊申請人對抗人球蛋白檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考。如申請人認為有必要增加本指導原則不包含的研究內容，可自行補充。 本指導原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發(fā)展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。 本指導原則適用于抗人球蛋白檢測試劑，同時適用于不同的檢測方法，如試管法、柱凝集法等，但不適用于血源篩查用抗人球蛋白檢測試劑。其他未盡事宜，應當符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第 5 號）（以下簡稱《辦法》）等相關法規(guī)要求。內容主要包括產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、有關產品主要研究結果的總結和評價以及同類產品在國內外批準上市的情況介紹等內容，其中同類產品上市情況介紹部分應著重從靈敏度、特異性、效價、重復性等方面寫明擬申報產品與目前市場上已獲批準的同類產品之間的異同。 明確抗體的來源，如為單克隆抗體應明確細胞株、克隆號等內容。 抗體如為自行生產，提供抗體的詳細生產及鑒定過程。 特異性：臨床有意義的已知血型系統(tǒng)至少 7 種，每種選 1 個抗體（ IgG），與對應的抗原陽性細胞均應檢測陽性。 效價：如采用倍比稀釋的方法驗證抗人球蛋白試劑的效價，分別采用 IgG和 /或 C3d致敏的細胞或根據廠家確立的研究方法進行驗證。應提交選擇比較過程，提交驗證試驗資料。 ：應說明組成成分，并對外觀、性狀、 pH 值等物理指標及功能性進行研究驗證。 。如抗體濃度的選擇確定過程、凝膠溶脹條件的確定、填充量及填充過程的研究資料，填充應確保均勻無氣泡，以及質量控制的要求。 反應體系的設置應符合《全國臨床檢驗操作規(guī)程》等公認標準操作規(guī)范、指南或標準的要求。 （四）分析性能評估資料 申請人應提交在產品研制或成品驗證階段對試劑進行的所有性能驗證的研究資料，對于每項分析性能的評價都應包括具體研究目的、實驗設計、研究方法、可接受標準、實驗數(shù)據、統(tǒng)計方法等詳細資料。分析性能評估的實驗方法可以參考國內或國際有關體 外診斷產品性能評估的指導原則進行。 分析性能評估試驗中應明確所有試驗每種試劑的用量、試劑紅細胞的濃度、采用的試驗方法（試管法、柱凝集法、微孔板法等）。 對于抗人球蛋白檢測試劑建議著重對以下分析性能進行研究： ： 提供臨床有意義的血型系統(tǒng)至少 7 種不規(guī)則抗體（ IgG）檢測靈敏度和特異 性的驗證資料，明確所檢出抗體的抗體效價的具體要求，可參照以下要求進行實驗。 C3d 凝集強度≥ 2+。 與已知抗體類型的血型抗體對應的 O 型相應抗原陰性紅細胞的反應