【正文】 的耗盡和有害 物質(zhì)的作用，細(xì)胞死亡數(shù)大于細(xì)胞分裂數(shù)。,第二十三頁，共一百一十二頁。ngd249。 sh249。ng)期,0 24 48 72 96 120 h,每代（群體）細(xì)胞生長的四個時期,第二十四頁，共一百一十二頁。,4.2.1 體外培養(yǎng)(p233。ng)、核酸的原料）、維生素（輔酶、輔基）、 其他大量和微量元素、促生長因子和激素（促進(jìn)細(xì)胞 生長、維持細(xì)胞功能、保持細(xì)胞分化和未分化狀態(tài)） 培養(yǎng)環(huán)境條件要求嚴(yán)格：溫度、滲透壓（多數(shù) 哺乳動物細(xì)胞260~320mOsm∕kg）、pH（及溶氧量 CO2和HO）的相對恒定、剪切力等。,第二十六頁，共一百一十二頁。iyǎng)條件和工具,一、培養(yǎng)條件： 1. 溫度： 2. pH： 3. 氣體： 4. 營養(yǎng)： 二、培養(yǎng)工具(gōngj249。,4.2.2 培養(yǎng)條件(ti225。n)和工具,一、培養(yǎng)條件： 溫度：多數(shù)哺乳動物37℃，偏離則影響代謝和 生長(shēngzhǎng)。 pH：最適7.2~7.4，低于高于7.6影響生長甚 至死亡。 O2 ？ CO2 ？ CO2培養(yǎng)箱？ 營養(yǎng)：需要氨基酸、維生素、輔酶、核酸、嘌 呤、嘧啶、激素和生長因子。,4.2.2 培養(yǎng)(p233。 種類：生物性液體（如血清）、組織浸液（如胚胎 浸液）、凝固劑（如血漿(xu232。 （1）血清：主要為牛（胎牛、新生牛、小牛）、 馬、雞、兔、羊、人血清。含各種血漿蛋 白、多肽、脂肪、碳水化合物、激素、生長因子及無 機(jī)物等，在生理平衡下促進(jìn)或抑制細(xì)胞生長。,第二十九頁，共一百一十二頁。oji224。 （3）雞胚浸出液：含生長因子、核蛋白、氨基 酸等，刺激細(xì)胞生長。用于原代和 細(xì)胞系的培養(yǎng)。,4.2.2 培養(yǎng)(p233。i)的生理環(huán)境，且便于控制和標(biāo)準(zhǔn)化。 使用時需加天然培養(yǎng)基。也稱通用培養(yǎng)基（可用于 許多細(xì)胞）?，F(xiàn)已有幾 十種，用途不同。,4.2.2 培養(yǎng)(p233。不需添加血清就可維持體外細(xì)胞 較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。 包括兩部分(b249。,第三十二頁，共一百一十二頁。iyǎng)條件——培養(yǎng)基,無血清培養(yǎng)基的添加成分： （1）細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）： 促進(jìn)貼壁。 FN促進(jìn)中胚層源細(xì)胞的貼壁和分化； LN作用于 內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)胚層源細(xì)胞。d242。（胰酶消化 傳代） （4）結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：如轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清 蛋白，增加黏度，免受機(jī)械損傷。,4.2.3 原代培養(yǎng)(p233。iyǎng)技術(shù),4.2.3.1 原代培養(yǎng) 組織塊培養(yǎng) 處死動物(d242。)，無菌取組織塊入小燒杯中，用尖嘴眼 科剪刀將組織塊剪碎，吸管吸取Hanks液沖下剪刀上 的碎片，補(bǔ)加35mLHanks液，用吸管輕輕吹打，低 速離心，棄去上清液，留下組織塊。,培養(yǎng)： 接種：接種量大小視情況而定；防污染；常規(guī)檢 查：12天做一次。)成片，布滿器皿表面時，則需 對其分離進(jìn)行重新培養(yǎng)。 2.酶消化的方法和細(xì)胞對酶的反應(yīng)：敏感/遲鈍 （酶作用時間和方法，細(xì)胞的類型和來源）,第三十五頁，共一百一十二頁。sh249。iyǎng)：細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行培養(yǎng)(p233。 （1）玻璃：明礬——硅硼膠玻璃。 （3）金屬：不銹鋼和肽。,4.2.4.2 貼壁培養(yǎng)的生長(shēngzhǎng)特性,游離期：接種的細(xì)胞，懸浮，細(xì)質(zhì)回縮變圓。貼壁 快：單個細(xì)胞，傳代細(xì)胞；貼壁慢：組織(zǔzhī)快，較大細(xì) 胞團(tuán)；不利于細(xì)胞貼壁的：細(xì)胞狀態(tài)不好，培養(yǎng)基pH 不正常，培養(yǎng)瓶不潔。經(jīng)一段停滯，開始分 裂。 退化期：細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶壁達(dá)一定密度，隨著營 養(yǎng)物的消耗和代謝物的積累，細(xì)胞開始退化。,4.2.5 動物(d242。)細(xì)胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法,懸滴培養(yǎng)(p233。,4.2.5.1 懸滴培養(yǎng)(p233。是最早 的傳統(tǒng)(chu225。,懸滴培養(yǎng)(p233。,4.2.5.2 旋轉(zhuǎn)(xu225。 優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)物交替地接觸培養(yǎng)液和氣體環(huán)境(hu225。ng)利于細(xì) 胞組織生長?？蓪⑴囵B(yǎng)物 接種在載玻片上，再入旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)，取載玻片觀察。,4.2.5.3 灌注(gu224。)小室培養(yǎng)法,灌注小室培養(yǎng)法：最初由Burrows（1912年）設(shè) 計。tǐ)流入和流出口。 后來的許多大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)在設(shè)計上都參考了此 方法的原理。,4.2.5.4 培養(yǎng)(p233。iyǎng)法,培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法：培養(yǎng)物直接接種在培養(yǎng)瓶內(nèi)，在放 入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 與此相關(guān)的方法：載玻片加培養(yǎng)瓶法。)和永 久保存；增加了培養(yǎng)面積。,4.2.5.5 培養(yǎng)(p233。iyǎng)法,培養(yǎng)板培養(yǎng)法：將培養(yǎng)物接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)， 放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。sh249。 常用的（一次性的）培養(yǎng)板：6孔、24孔、96孔 （96孔最常用）。,4.2.6 動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)(p233。包 括懸浮培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng)、中空纖維 法、微多孔載體培養(yǎng)等。,4.2.6.1 懸浮培養(yǎng)(p233。 動物活體組織分散、過濾、離心、純化、漂 洗，接種到適宜培養(yǎng)液中，于特定培養(yǎng)條件下 培養(yǎng)。,,,酶消化形成(x237。ng) 分散細(xì)胞,加培養(yǎng)液終止(zhōngzhǐ) 消化吹打分散 形成分散細(xì)胞,剪切成細(xì)快,酶消化、吹打(chuīdǎ)分散 形成細(xì)胞懸浮液,逐級稀釋,細(xì)胞懸浮液制備過程示意圖,…,第四十六頁，共一百一十二頁。itǐ)培養(yǎng)技術(shù),最初在培養(yǎng)液中加小滾瓶增加貼壁細(xì)胞的生長面 積，此法構(gòu)造(g242。o)簡單，成本低，重復(fù)性好，簡單易行。 微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞技術(shù)(Van Wezel,1967): 一定程度上改變了其不足、最初的載體為離子交換樹 脂微珠（60~250微米）。,第四十七頁，共一百一十二頁。itǐ)培養(yǎng)技術(shù),細(xì)胞支持物（微載體基質(zhì)） 應(yīng)具備的特征： 1. 生物相容性； 2. 簡便的無毒害固定化 3. 良好的傳質(zhì)特性； 4.良好的機(jī)械(jīxi232。bāo)免受機(jī)械損傷； 11.接種方便； 12.能固定大部分細(xì)胞； 13.適合大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)； 14.細(xì)胞載體培養(yǎng)基易分離； 15.適于貼壁和懸浮培養(yǎng)；,第四十八頁，共一百一十二頁。iyǎng)技術(shù),將細(xì)胞包裹在微囊中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。 20世紀(jì)80年代(ni225。i)初（Lim和Sum）制成了細(xì)胞能在其 中生長的微囊。,第四十九頁，共一百一十二頁。i)法,中空纖維法：1972年（Richard Kncazek）發(fā)明。 3~6層空心纖維構(gòu)成培養(yǎng)系統(tǒng)，細(xì)胞接種于空心纖 維的外腔。n)。,第五十頁，共一百一十二頁。itǐ)培養(yǎng)技術(shù),傳統(tǒng)實心微載體的不足：只能固定貼壁細(xì)胞、后期 細(xì)胞老化而脫落、貼壁需血清中的因子幫助(bāngzh249。 微多孔載體培養(yǎng)：克服了其不足。 優(yōu)點(diǎn)：降低血清用量、易固定化、比表面積大、細(xì) 胞免受機(jī)械損傷、適合于懸浮細(xì)胞的固定化連續(xù)灌流 培養(yǎng)、也適合于大規(guī)模高密度培養(yǎng)系統(tǒng)。,4.2.6.5 微多孔載體培養(yǎng)(p233。 制備(zh236。i)：1. 成球材料和臨時性成孔材料分散于介質(zhì) 中液滴，2. 液滴固化成小球，3. 去除（如高溫?zé)Y(jié)） 臨時性成孔材料，形成多孔微球，4.后期處理——表 面處理、清洗、滅菌等。,,多孔微載體(z224。ili224。n) 介質(zhì),成 球,成孔,去除球中的成孔物質(zhì),后期處理,多孔微載體,第五十三頁，共一百一十二頁。b232。b232。 1. 高溫?zé)Y(jié)法：玻璃、陶瓷等。,第五十四頁，共一百一十二頁。itǐ)的制備方法,2. 高分子材料成球聚和法： 水（懸浮分散介質(zhì)）加分散劑，強(qiáng)力攪拌→不溶 于水的單體分散成小液珠→加引發(fā)劑（油溶性） →成 珠狀小球→100~105 ℃去除未反應(yīng)的單體和成孔物質(zhì)(w249。) →稀酸清洗夾在微球中的分散劑→多孔微球→氧化劑 處理使其表面極化→親水的多孔載體。,2.4.6.5 微多孔載體的制備(zh236。i)方法,3.聚合物快速凝聚法：海藻酸鈉溶液在氯化鈣溶液 中快速凝聚成球。,第五十六頁，共一百一十二頁。b232。) →加熱、減壓、溶劑萃取、冰凍干燥等去除成孔材料 →多孔微球。,4.2.7 動物細(xì)胞生物(shēngw249。因為動物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁、非常脆弱、對剪切 敏感、對培養(yǎng)環(huán)境要求嚴(yán)格。i)越來 越多，規(guī)模越來越大。 國外，氣升式反應(yīng)器已放大到5 000~10 000L，攪 拌式反應(yīng)器達(dá)到8 000L。,4.2.7 動物細(xì)胞生物(shēngw249。 利用動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物活性物質(zhì)具有獨(dú)特的 作用和意義，也是植物(zh237。)、微生物細(xì)胞培養(yǎng)所無法替代 的。 動物細(xì)胞能精確地轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工較大或更復(fù)雜的 蛋白質(zhì)（特別是加工蛋白質(zhì)的環(huán)境、過程、結(jié)果等是 植物微生物細(xì)胞極少有的）；能將目的蛋白分泌到培 養(yǎng)液中，從而簡化了蛋白質(zhì)的分離、純化。,4.2.7 動物細(xì)胞生物(shēngw249。ngtǐ)免疫調(diào)節(jié)劑：如干擾素（IFN）、白細(xì)胞 介素（IL）、B細(xì)胞生長因子（BCGF）、巨噬細(xì)胞激 活因子（MAN）、T細(xì)胞替代因子(TRF)等。,第六十頁，共一百一十二頁。iyǎng)的應(yīng)用,酶類：組織血纖維溶酶原激活計（tPA）等； 激素：紅細(xì)胞生產(chǎn)素（EPO）、促黃體生成素 （LH）、促濾泡素（FSH）。ngyu225。,第六十一頁，共一百一十二頁。)反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng),三、關(guān)鍵技術(shù) （一）細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境(hu225。ng) 1.氨離子 2.乳酸 3.二氧化碳 4.甲基乙二醛 5.滲透壓 6.載體 （二）細(xì)胞死亡與凋亡 （三）培養(yǎng)基與細(xì)胞系 （四）過程監(jiān)控,第六十二頁，共一百一十二頁。)反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng),三、關(guān)鍵技術(shù)： （一）細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境： 氨離子(l237。氨的積聚（來源于培養(yǎng)基和細(xì)胞的代謝）使細(xì) 胞內(nèi)UDP氨基己糖增加，影響細(xì)胞的生長和蛋白質(zhì)糖基化過 程。 乳酸：糖代謝產(chǎn)物。因此應(yīng)減少培養(yǎng)基中葡萄糖的濃 度（以減少乳酸）同時平衡葡萄糖與Gln的比例。,關(guān)鍵技術(shù)——細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境(hu225。ng)：,二氧化碳：CO2 累積改變 細(xì)胞(x236。bāo)產(chǎn)生 毒性。 甲基乙二醛（MG)：為丙糖磷酸去磷酸基（主要）、 脂類、氨基酸代謝產(chǎn)物。MG能改變氨基 酸、蛋白質(zhì)和核酸的氨基和巰基。加小牛血清可降低MG的濃度。,關(guān)鍵技術(shù)——細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境(hu225。ng)：,滲透壓：高滲透壓提高細(xì)胞生產(chǎn)抗體的濃度、影響對數(shù) 生長期長短、細(xì)胞死亡速度。 載體：用多孔微載體替代常規(guī)載體（細(xì)胞易受機(jī)械(jīxi232。,第六十五頁，共一百一十二頁。)反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng),（二）細(xì)胞死亡與凋亡： 細(xì)胞系在生物反應(yīng)器中死亡主要是細(xì)胞凋亡。d249?？赏ㄟ^基因工程方法將bel2這種抑 制細(xì)胞調(diào)亡的基因?qū)爰?xì)胞。,第六十六頁，共一百一十二頁。)反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng),（三）培養(yǎng)基與細(xì)胞系： 培養(yǎng)基：歷經(jīng)天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基到現(xiàn)今的無 血清培養(yǎng)基。 細(xì)胞系或細(xì)胞珠不同，其無血清培養(yǎng)基需求不同， 在細(xì)胞早期培養(yǎng)階段(jiēdu224。,第六十七頁，共一百一十二頁。)反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng),（四）過程監(jiān)控： 因大量細(xì)胞的代謝，培養(yǎng)環(huán)境會迅速改變，過程的 再線監(jiān)控是非常重要的。 在線測定：培養(yǎng)條件、代謝產(chǎn)物、目的(m249。)產(chǎn)物等是大 規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞的需要。,第六十八頁，共一百一十二頁。nzhu224。 2.細(xì)胞群體在大規(guī)模、長時間培養(yǎng)過程中分泌產(chǎn)物能 力易丟失，或產(chǎn)物活性易降