基因工程研究策略和實踐-在線瀏覽
2024-10-22 20:49本頁面
【正文】 因工程過程示意圖 ① 從細胞中分離出 DNA ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ② 限制酶截取DNA片斷 ③提取大腸桿菌中的質粒 ④ DNA重組 ⑤ 用重組質粒轉化大腸桿菌 ⑥ 培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因 /使其表達 ③③基因工程的研究策略 一、目的基因的分離 ( donor DNA ) 二、載體 DNA及其改造 (Vector DNA) 三、體外 DNA重組 (DNA rebination ) 四、重組 DNA的轉化 ( Transformation) 五、重組體的篩選鑒定與克隆擴增 ( identification amp。 常用載體 質粒 病毒載體 噬菌體 粘性質粒 /粘粒 載體的選擇標準 ? 有復制起點，能自主復制； ? 具有篩選標記，便于重組體的篩選和鑒定； ? 具有一種或多種限制性內切酶的單一切割位點，并在位點中插入外源基因后，不影響其復制功能； ? 分子量小，以容納較大的外源 DNA。 克隆載體 (cloning vector) 為使插入的外源 DNA序列被擴增 而特意設計的載體稱為 克隆載體 。 載體的分類 按作用分 穿梭載體 (shuttIe vector) 又稱 雙功能載體 (bifunctional vector)。 其可同時具有細菌質粒的復制原點和真核生物可識別的病毒復制原點或酵母菌的自主復制序列 （ ARS） ， 它即能在 原核細胞中擴增 又能在 真核細胞中復制和表達 。 如 pKSV一 pJDB219載體等。 (2)松馳型 。 (4)具有數個或一個單一的酶切點 。 （ 2） 游離型載體 ：能夠以病毒顆粒的形式在宿主內自行復制或在輔助病毒存在下進行復制。 噬菌體載體 現用的 λ 噬菌體載體都是在野生型基礎上改造而成的。 如 λ gt λ gt11； ② 替換型載體 ，具有成對的克隆位點，在兩個位點之間的 λ DNA區(qū)段可被外源插入的 DNA片段取代， 能插入較大的外源 DNA片段 (2024kb左右 )。 4. Cosmid質粒 由 λ DNA cos區(qū)與質粒重組建造而成。 分子量小（約 4— 6kb），可容納大至 4050kb的外源 DNA片段。 如 cosmid pHC79 三、體外 DNA重組 ? 概念： 不同來源的 DNA片段 共價連接 、通過重新組合構成了具有兩個 DNA分子遺傳信息的新 重組體 DNA分子的過程。 識別序列的特點 ； (I)專一； (2)常由 4–6個堿基組成； (3)具有回文序列 ? 經切割可以生成平頭末端或粘性末端。 DNA連接酶 ― “ 分子針線” ? 連接雙鏈 DNA分子中相鄰 3’ OH和5’ 磷酸基之間的磷酸二酯鍵的形成。 1. 粘末端連接 （ a） 目的基因和載體用 同一種限制酶切割 后連接。 用 堿性磷酸酶 (能除掉 DNA5’ 端 P基團 ， 使 5’端帶一
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