【正文】 知功能的抗病基因，則需進行大量的抗病接種鑒定 例如：抗病基因的克隆 注： NBS： nucleotide binding sequence LRR: Leucinerich repeat 利用同源序列法克隆 Rx2 ? Rx1 和 Rx2 抗同一馬鈴薯病毒（ PVX）， 但兩個 基因存在于不同品種中，分別位于第 XII 和第 V 染色體上 ? 用 Rx1 的同源序列分離克隆 Rx2 基因 Bendahmane et al. Plant J 2022, 21:7381 覆蓋 Rx1 起始和終止密碼的 PCR 引物擴增含 Rx2 的總 DNA 200個 同源序列 構建轉化載體 Rx1Pro 同源序列 Rx1Ter 野生型馬鈴薯 含 PVX無毒基因的 轉基因 馬鈴薯 無過敏反應 過敏反應 轉化 Agoinfiltration transient transformation gene to gene hypothesis 五、 mRNA 差異顯示法 (未知序列基因克?。? mRNA differential display 3’ 錨定引物 AGAAAAAAA GGAAAAAAA ATAAAAAAA GTAAAAAAA ACAAAAAAA GCAAAAAAA 5’ 隨機引物 (10 bp) 放射性標記 dNTP Liang et al. Science 1992, 257: 967 971 ? Reamplify and confirm by Northern blot ? Clone and sequence ? Conduct further studies: Cut out differentially expressed bands and: ? Generate fulllength cDNAs ? Obtain genomic clones or regulatory sequences 該方法的優(yōu)缺點： 優(yōu)點： （ 1）可以同時比較多個樣品間基因表達差異； （ 2）可以同時檢測到“上游”及“下游”基因； （ 3）檢測靈敏度高，所需樣品少，一些低豐度 mRNA也能被檢測出來； 缺點： （ 1）假陽性的比例甚高，假陽性率高達 50~70%； （ 2）擴增的差別條帶的分子長度比較短，大多在 110450bp之間。 原理： 首先，把兩個群體分離的 mRNA反轉錄成 cDNA；我們把含有特異基因表達的群體的 cDNA做 “ tester”，參照群體的 cDNAs為 driver； 然后在 driver過量的情況下將兩者進行雜交，除去雜交的序列；結果，那些未雜交的 cDNAs即是 tester中特異表達的 mRNA. 六、抑制性扣除雜交法 (未知序列基因克隆） （ suppression subtractive hybridization, SSH) ※ 特別實用于分離在特定組織中表達的基因，在細胞周期特定階段表達的基因，受生長因子調節(jié)的基因，以及在特定發(fā)育階段表達的或者是參與發(fā)育調節(jié)的基因。 Diatchenko et al . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996,93: 60256030 工作流程： cDNA synthesis Tester and driver ds cDNA are prepared from the two mRNA samples under parison Rsa I digestion Tester and driver cDNA are separately digested to obtain shorter, bluntended molecules Adaptor ligation Two tester populations are created with different adaptors, but driver cDNA has no adaptors First hybridization Hybridization kiics lead to equalization and enrichment of differentially expressed sequences Second hybridization Templates for PCR amplification are generated from differentially expressed sequences First PCR amplification Using suppression PCR, only differentially expressed sequences are amplified exponentially Second PCR amplification Background is reduced and differentially expressed sequences are further enriched Plant Physiol. 138:20872096, 2022 SSH 實例 1：分離耐低磷基因 SSH 實例 2：分離螟蟲特異性表達基因 將扣除雜交技術和 cDNA點陣技術相結合，得到水稻被二化螟誘導表達的基因，推測水稻對二化螟防御反應分子機制，克隆并鑒定水稻被二化螟特異誘導表達的啟動子。 Hua et al. Plant Mol. Biol. 2022, 65:519530 SSH 兩輪 PCR的結果 SSH 文庫的檢測 SSH cDNA 文庫的 macroarry檢測 候選克隆的 Northern驗證 通過 SSH的方法分離到螟蟲誘導性的啟動子 七、酵母雙元雜交系統(tǒng) Yeast Twohybrid System 酵母雙元雜交系統(tǒng)的應用 ? 驗證傳統(tǒng)方法檢測的相互作用的蛋白 ? 蛋白的功能作圖 – 功能域 /氨基酸 ? 鑒別新的相互作用蛋白 (from a cDNA library) 本項技術已被廣泛地應用于真核基因的表達和調控、細胞粘合因子間的相互作用、信號傳導路徑以及細胞周期與分化、反式因子的鑒定與分離等諸多領域。然后，通過分離轉座子兩側的宿主基因組的 DNA序列，從文庫中分離目的基因。美國能源部 (DOE)提出“人類基因組計劃”草案 ? 1987 美國能源部和國家衛(wèi)生研究院（ NIH）聯合為“人類基因組計劃”下撥啟動經費約 550萬美元 ? 1989 美國成立“國家人類基因組研究中心”，Watson擔任第一任主任 ? 美國國會批準，人類基因組計劃正式啟動 ? Craig Venter離開 NIH，建立基因研究所