分離工程第八章ppt課件-在線瀏覽
2024-10-22 18:21本頁面
【正文】 膠電泳中的分子篩效應(yīng) ? 在使用凝膠介質(zhì)的電泳中，由于電泳介質(zhì)具有高粘度和高的摩擦阻力，因此不僅可以防止對流，而且可以把擴(kuò)散減到最小。 A B C + ?常用的凝膠材料：聚丙烯酰胺、瓊脂糖凝膠。 ?凝膠電泳使用的凝膠種類和濃度根據(jù)分離料液中溶質(zhì)的相對分子質(zhì)量而異。 垂直電泳槽及灌膠模具 電泳的一般過程 聚丙酰胺電泳 凝膠電泳與凝膠過濾的區(qū)別 ?在凝膠電泳中，樣品混合物中各分子的運動速度是小分子大于大分子物質(zhì)，這種凝膠過濾中的情況恰好相反，這是因為在凝膠電泳中，系統(tǒng)里沒有空隙體積，只有充滿整體凝膠的網(wǎng)狀骨架，因此在其內(nèi)部大分子物質(zhì)不及小分子物質(zhì)容易移動。 ? 因此，在使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)分離時，在電泳過程中 不僅取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，還取決于蛋白質(zhì)的尺寸和形狀。因此，pH應(yīng)限制在 3~10之間。 ? 一般選擇緩沖液的離子強(qiáng)度為 ~ mol/L之間 凝膠濃度的選擇 ? 由于 PAGE電泳分離不僅取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，而且取決于分子的大小、形狀。 ? 根據(jù)凝膠孔徑與被分離分子的大小和形狀，可以將凝膠分為： –非排阻性凝膠（ unrestrictive gel） :濃度 ~%的瓊脂糖凝膠； –排阻性凝膠（ restrictive gel） ：濃度大于 1%的瓊脂糖凝膠和常規(guī) PAGE ?凝膠濃度太大，孔徑小于樣品分子尺寸，電泳時蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠，樣品仍留在加樣位置； ?凝膠濃度太小，孔徑太大，樣品中各種蛋白質(zhì)分子均隨緩沖液推進(jìn)，不能得到很好的分離； 凝膠濃度 (C=%) 分子量范圍 (kDa) 凝膠濃度 (C=5%) 分子量范圍 (kDa) 5 30~200 5 60~700 10 15~100 10 22~280 15 10~50 15 10~200 20 2~15 20 5~150 凝膠濃度與分子量測定的關(guān)系 PAGE的具體操作過程 ? 制膠：確定凝膠配方（凝膠、引發(fā)劑、增速劑的濃度和緩沖液），使用灌膠模具灌膠； ? 樣品準(zhǔn)備：選擇合適的樣品緩沖液、確定合適的樣品濃度（ 1~2mg/L，考染），加樣（溴酚藍(lán)）； ? 電泳： 4~6小時，待 溴酚藍(lán) 前沿到達(dá)陽極底部； ? 檢測：紫外掃描或染色（考馬斯亮藍(lán) R250、銀染色 —靈敏度比考染高 100倍、熒光探針）； ? 照相、凝膠干燥： ? 定量測定： ?凝膠電泳：裝柱操作，鋪板操作。 ? B、十二烷基硫酸鈉 (SDS)—聚丙烯酰胺凝膠電泳。 ?聚丙烯酰胺凝膠電泳：以聚丙烯酰胺為支持物，制成凝膠柱。這二節(jié)膠孔徑大小，緩沖液離子成分和離子強(qiáng)度值，電場強(qiáng)度都是不同的。 ?一般經(jīng)過三個效應(yīng)，濃縮效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，電荷效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。 ?主要用途： ?分離蛋白質(zhì)和測定它的相對分子量。 ?基本原理： ? SDS能以一定比例與蛋白質(zhì)結(jié)合，并使蛋白質(zhì)帶有大量的負(fù)電荷，（大大超過原來所帶電荷），從而使天然蛋白質(zhì)分子之間電荷差別下降乃至消除。 SDSPAGE 的原理 ? 蛋白質(zhì)分子的解聚 – SDS是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶性試劑，能 斷裂分子
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