【正文】 取生長良好的細胞，在超凈工作臺用無菌吸管 把培養(yǎng)瓶中的細胞吹打均勻。 (區(qū)別貼壁傳代 ) ?在超凈工作臺中吸去上清液，加入適量新培養(yǎng)液，用吸管吹打細胞，制成懸液。 ?觀察：細胞培養(yǎng) 24h后，即可進行觀察。爭取拿到的標本新鮮、無菌、少壞死等。 人體活檢 (或手術 )材料 ?標本放入收集瓶后，送出手術間，立即送往組織培養(yǎng)實驗室。但有時手術時間難以掌握。 ?取臨床標本時，雖然盡可能做到無菌操作，但仍有污染可能性的存在。如手術標本比較大（約 200mg以上），可將其浸于 70%酒精中約 3060秒，這樣會減少表面污染而不損壞內部組織的結構和存活。 人體活檢 (或手術 )材料 ? 整個取材過程中，都要注意保持組織的濕潤，隨時給組織塊滴加一些培養(yǎng)液或平衡鹽溶液。 ? 在剪碎或切割組織塊時，盡量使用 鋒利的 刀剪，防止以鈍器對組織揉、捻、撕拉等而造成細胞損傷。在萬不得已的情況下，取材后也可將組織貯存在冷的 (4 ℃ )含平衡鹽溶液 (或其它緩沖鹽溶液 )的營養(yǎng)液中，最好不超過 2448 h(視不同組織類型而定 )。 ? 任何培養(yǎng)瓶內生長的細胞都由死細胞和活細胞組成 ， 從形態(tài)上區(qū)別死 、 活細胞是困難的 。 血細胞計數板人工計數 細胞計數器 血細胞計數板：常用的是改良的紐巴氏(Neubauer)血細胞計數板。當 chamber 上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為 1 mm2 mm= 104 ml。 ? 存活測試為利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。 ，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數板之間，靜置 3 min，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。 然后按公式計算： 細胞數 /mL=四大格細胞總數 /4 104 稀釋倍數 注意：鏡下偶見有兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團 10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液 ? 由于 死細胞 的 細胞膜通透性 發(fā)生改變，某些染料可大量進入卻不被排出，因而細胞 呈色 。此法的原理即是 利用死、活細胞對染料的不同反應 而區(qū)分開兩種細胞。 臺盼藍排除檢測法 ①將 1滴細胞懸液 (貼壁細胞可經 ％胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成細胞懸液 )與 2滴臺盼藍液 混合后， 滴入細胞計數板 。未著色的為活細胞，呈藍色的為死細胞。 活體染色與細胞計數 細胞生長曲線的繪制 ? 細胞生長曲線 (cell growth curve)是觀測細胞在一代生存期 內的 增生過程 的重要指標，可根據細胞生長曲線分析 細胞增殖速度 ，確定 細胞傳代 、 細胞凍存 或 具體實驗 的最佳時間。 ? 1)培養(yǎng)細胞 首先 在 2４孔培養(yǎng)板內分別接種 相同數量的 細胞。接種時間記為 0 h。為提高準確率，對每孔細胞可計數 23次。 ? 3)繪制曲線 以培養(yǎng)時間為橫坐標、細胞密度 為縱坐標，將全部結 果在坐標紙 上繪圖，即得所培養(yǎng)細胞的生長 曲線。 ? 二甲亞砜（ DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺與所含的 formazan量成正比，用酶標儀測定 OD570nm值。 四唑鹽（ MTT）比色法 ?操作步驟 四唑鹽（ MTT）比色法 ① 100 ?L單細胞懸液接種于 96孔板 (5 104)。 吸出孔內培養(yǎng)液后 ，加入 DMSO液（ 150 ?L/孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩 10 min，使結晶物溶解。記錄結果。 ?吸去培養(yǎng)液時動作要慢 ,以免吸去形成的結晶。 ? 1900年前后，科學家基本上肯定了生物成分 (如精子 )能夠在零下溫度貯存的事實。 ? Luyet(1951)與 Lovelock(1953)等多位學者發(fā)現 電解質濃度增大 是造成冷凍貯存細胞損傷的主要原因。 ? 當前低溫液氮凍存貯存細胞已是細胞培養(yǎng)室常規(guī)性通用技術 ，貯存時間幾乎是無限的。 ? 復蘇 (thawing)：以一定的 復溫速率 將凍存的培養(yǎng)物 恢復到常溫 的過程。 影響冷凍效果的因素 2. 冷凍保存溫度 液氮溫度（ 196 ℃ ）是目前最佳冷凍保存溫度。 3. 復溫速率 是在細胞復蘇時溫度升高的速度 一般復溫速度越快越好 12 min內從 196 ℃ 升溫至 37 ℃ （水浴鍋）。 滲透性：甘油、 DMSO 非滲透性：聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、蔗糖、聚乙二醇 影響冷凍效果的因素 甘油或 DMSO分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，且對細胞無明顯毒性。在使用該類冷凍保護劑時，需要一定的時間進行 預冷 。 ? 傳統程序 ：冷凍管置于 4℃ 1 h→ 20℃ 1 h→ 80℃ 1618 h(或隔夜 ) → 液氮槽長期儲存 低溫保護劑的應用 ? 在細胞凍存時加入低溫保護劑，能大大提高凍存效果。 ? 常溫下 DMSO對細胞的毒副作用較大，在 4 ℃ 時，其毒副作用大為減弱，凍存時 DMSO平衡應在 4 ℃ 下進行。液氮長期保存 注意事項 1. 控制凍存細胞的質量 2. 不宜將凍存的細胞放置在 20 ℃過長時間，易引起低溫損傷 3. 凍存小管宜用塑料凍存管 保存細胞的復蘇方法 ? 快速解凍 – 凍存細胞從液氮中取出后，立即放入 37 ℃ 水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在 1 min內（不要超過 3 min）全部融化 ? 解凍后的細胞可直接接種到含完全生長培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)， 24 h后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO ? 如果細胞對冷凍保護劑特別敏感 – 解凍后的細胞應先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含完全生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中 1. 準備水浴 2. 取凍存管，入水浴快速晃動至完全融化 3. 去除 DMSO 4. 加入培養(yǎng)基制成細胞懸液，移入培養(yǎng)瓶培養(yǎng) 注意事項 1. 盡快使細胞恢復到常溫 2. 盡快離心棄去冷凍保護液，防止對細胞的毒害 凍存和復蘇的原則： 慢凍快融 ? 冷到零度以下，細胞可以產生以下變化： 細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶 。 復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶 ，即冰晶的重結晶。 ? 如果不了解所要細胞的性狀、培養(yǎng)液特點及培養(yǎng)注意事項，運輸時不注意使用特殊容器或溫度等，就可能影響細胞的生長，或出現差錯，或導致培養(yǎng)失敗等。 ? 保存效果較好，但缺點是比較麻煩，不宜長時間運輸，多需空運，代價較大。運輸時間需 45 d，一般放在貼身口袋即可，到達目的地后倒出多余的培養(yǎng)液，只需保留維持生長所需的培養(yǎng)液置 37℃ 培養(yǎng)，次日傳代?？扛街诩毎砻娴呐囵B(yǎng)液，可使細胞短時間不受損。 證明細胞系的種系