【正文】 060秒，這樣會減少表面污染而不損壞內部組織的結構和存活。 ? 在剪碎或切割組織塊時，盡量使用 鋒利的 刀剪，防止以鈍器對組織揉、捻、撕拉等而造成細胞損傷。 ? 任何培養(yǎng)瓶內生長的細胞都由死細胞和活細胞組成 ， 從形態(tài)上區(qū)別死 、 活細胞是困難的 。當 chamber 上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為 1 mm2 mm= 104 ml。 ，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間，靜置 3 min，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。此法的原理即是 利用死、活細胞對染料的不同反應 而區(qū)分開兩種細胞。未著色的為活細胞，呈藍色的為死細胞。 ? 1)培養(yǎng)細胞 首先 在 2４孔培養(yǎng)板內分別接種 相同數(shù)量的 細胞。為提高準確率，對每孔細胞可計數(shù) 23次。 ? 二甲亞砜（ DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺與所含的 formazan量成正比，用酶標儀測定 OD570nm值。 吸出孔內培養(yǎng)液后 ，加入 DMSO液（ 150 ?L/孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩 10 min，使結晶物溶解。 ?吸去培養(yǎng)液時動作要慢 ,以免吸去形成的結晶。 ? Luyet(1951)與 Lovelock(1953)等多位學者發(fā)現(xiàn) 電解質濃度增大 是造成冷凍貯存細胞損傷的主要原因。 ? 復蘇 (thawing)：以一定的 復溫速率 將凍存的培養(yǎng)物 恢復到常溫 的過程。 3. 復溫速率 是在細胞復蘇時溫度升高的速度 一般復溫速度越快越好 12 min內從 196 ℃ 升溫至 37 ℃ （水浴鍋）。在使用該類冷凍保護劑時，需要一定的時間進行 預冷 。 ? 常溫下 DMSO對細胞的毒副作用較大，在 4 ℃ 時，其毒副作用大為減弱，凍存時 DMSO平衡應在 4 ℃ 下進行。 復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶 ，即冰晶的重結晶。 ? 保存效果較好，但缺點是比較麻煩，不宜長時間運輸，多需空運，代價較大?？扛街诩毎砻娴呐囵B(yǎng)液，可使細胞短時間不受損。 培養(yǎng)物的準備和固定前處理 各種細胞培養(yǎng)物。 1） Giemsa染色 染色步驟 （蓋片培養(yǎng)或涂片法）： 1） Sorensen buf和 Giemsa染液 9:1體積比混合即得到染色液 2）用甲醇固定細胞標本 10 min，或醋酸 /甲醇 (1:3)固定 30 min 3）用滴管將染色液布滿材料面（不要有氣泡） 4）染色 1015 min，用自來水將玻片沖洗干凈，空氣干燥，二甲苯透明 5）光學樹脂膠封片后觀察 結果： 細胞核染成紫紅色或藍紫色，胞漿染成粉紅色 2）蘇木精 伊紅染色 ? 染液制備： 1）蘇木精染液 (20 ): 蘇木精 g，銨礬 (NH4)2SO4Al2(SO4)3 24g， H2O 50 ml， NaIO3 g，甘油 30 ml，冰醋酸 2 ml。 ? 染液配制： 用生理鹽水將 AO配成 1%的母液，冰箱保存，用時則 M的 PBS（ pH ）稀釋成 %工作液。 ? 構造： 機械部分 /照明部分 /光學部分 光學顯微鏡的種類 反差方式 機制 說明 亮視野 反差取決于光吸收 常結合組織染色技術來提高反差 相差 將相位差轉變?yōu)檎穹? 反差與局部的相密度成正比，包括線粒體、染色體、溶酶體等 分光干涉相差 轉換通過樣品的光程相位差的變化率 光經過細胞和細胞器邊緣時光程突然變化形成強烈反差 暗視野 散射光觀察 產生細胞和細胞器邊緣的輪廓圖像 干涉反射 反差取決于相互靠近的空間表面之間發(fā)生的衍射 用于觀察細胞培養(yǎng)中細胞與基底間的接觸帶 偏振光 在低于光學分辨率的情況下檢測具有雙折射性的超分子組織結構 用于定性排列結構的研究，如細胞骨架、有絲分裂的微管以及強韌纖維、膜的觀察 熒光 反差取決于熒光基團的光吸收及光衍射 僅限于適當?shù)淖园l(fā)熒光和熒光標記 光學顯微鏡觀察的一般過程 普通光學顯微鏡 相差顯微鏡 熒光顯微鏡 暗視野顯微鏡 偏振光顯微鏡 干涉顯微鏡 掃描隧道顯微鏡 原子力顯微鏡 視頻顯微鏡 共聚焦顯微鏡 1）相差顯微鏡 調節(jié)： 1）將顯微鏡合軸，并把視野圈開大至與聚光器光闌邊緣一致 2）將與物鏡放大倍數(shù)一致的相板放入聚光器中 3）把調中目鏡換到目鏡筒中，旋動調中目鏡上的調焦環(huán)至相板相環(huán)的圖像清晰（分別是兩個明暗不同的圓形圖像） 4）調節(jié)聚光器上的相環(huán)調中旋鈕（注意不要旋動聚光器的調中紐），使兩個圓環(huán)圖像重疊成同心圓 5）用普通目鏡換下調中目鏡并觀察 1）相差顯微鏡 注意事項： 1）換不同倍率的物鏡時，要選用一致的相板和相環(huán)，并重新調中 2）載物片或培養(yǎng)瓶的表面要平整、均勻、干凈，標本不能太厚，以免影響觀察效果 3）標本要在有水的環(huán)境中（如培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)液、水封片等）成像效果才明顯 4）光路上最好加單色（如黃綠色）濾光片，使其分辨率達到最高 2）熒光顯微鏡 調節(jié)： 1）打開電源開關，當電壓表的指針穩(wěn)定在 220 V時，打開高壓汞燈開關，預熱 10 min，移開光簾，光線進入光路 2）將燈前鏡擺出光路，插入合適濾光片；把標本放在載物臺上，選25 物鏡，調焦到成像；調節(jié)聚光器調中鈕使光圈圖像居中，然后恢復光圈到與視野等大 3）將燈前鏡擺入光路，撥動燈前鏡調焦桿，使燈影光斑清晰；調節(jié)燈泡調中鈕使燈影光斑居中，然后調節(jié)反射鏡調中鈕，使反射影光斑居中；最后將燈前鏡擺出光路，即可觀察樣品 2）熒光顯微鏡 注意事項： 1）觀察對象必須是自發(fā)熒光或已被熒光染料染色的標本 2）載物片、蓋玻片及鏡油應不含自發(fā)熒光雜質 3）選用效果好的濾光片 4）熒光標本很易褪色，操作、觀察要迅速 5）啟動高壓汞燈后，不得在 15 min內將其關閉；關閉后，必須待汞燈冷卻后方可再次打開 6）若暫不觀察標本，可用阻光光簾阻擋光線，以保護標本 7）若常時間觀察熒光標本最好戴護目鏡 3）暗視野顯微鏡 調節(jié)： 1）按調節(jié)普通顯微鏡方法調節(jié)好后，換上暗視野聚光器和被檢標本片 2）調節(jié)聚光器和物鏡的上下工作距離，看到標本的圖像 3）調節(jié)聚光器的上下軸和中軸，在視野清晰的前提下，背景越暗越好 4）把燈泡亮度、視野光圈和聚光器的孔徑光圈開到最大，此時暗視野效果最佳 3）暗視野顯微鏡 注意事項： 1）聚光器與物鏡的數(shù)值孔徑應合理匹配，物鏡的數(shù)值孔徑必須小于聚光器的數(shù)值孔徑 2）蓋玻片和載物片應清潔無痕，否則，會出現(xiàn)明亮的散射光影響觀察 3）必須在聚光鏡和載片之間加香柏油，以維持暗視野和保證觀察效果 4）激光共聚焦掃描顯微鏡 激光共聚焦掃描顯微系統(tǒng)由一個激光掃描顯微鏡在物鏡的成像面上加一個針孔