浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-基本技術(shù)-預(yù)覽頁
【正文】 060秒，這樣會減少表面污染而不損壞內(nèi)部組織的結(jié)構(gòu)和存活。 ? 在剪碎或切割組織塊時，盡量使用 鋒利的 刀剪，防止以鈍器對組織揉、捻、撕拉等而造成細(xì)胞損傷。 ? 任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成 ， 從形態(tài)上區(qū)別死 、 活細(xì)胞是困難的 。當(dāng) chamber 上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為 1 mm2 mm= 104 ml。 ，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間，靜置 3 min，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。此法的原理即是 利用死、活細(xì)胞對染料的不同反應(yīng) 而區(qū)分開兩種細(xì)胞。未著色的為活細(xì)胞，呈藍(lán)色的為死細(xì)胞。 ? 1)培養(yǎng)細(xì)胞 首先 在 2４孔培養(yǎng)板內(nèi)分別接種 相同數(shù)量的 細(xì)胞。為提高準(zhǔn)確率，對每孔細(xì)胞可計數(shù) 23次。 ? 二甲亞砜（ DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的 formazan量成正比，用酶標(biāo)儀測定 OD570nm值。 吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后 ，加入 DMSO液（ 150 ?L/孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩 10 min，使結(jié)晶物溶解。 ?吸去培養(yǎng)液時動作要慢 ,以免吸去形成的結(jié)晶。 ? Luyet(1951)與 Lovelock(1953)等多位學(xué)者發(fā)現(xiàn) 電解質(zhì)濃度增大 是造成冷凍貯存細(xì)胞損傷的主要原因。 ? 復(fù)蘇 (thawing)：以一定的 復(fù)溫速率 將凍存的培養(yǎng)物 恢復(fù)到常溫 的過程。 3. 復(fù)溫速率 是在細(xì)胞復(fù)蘇時溫度升高的速度 一般復(fù)溫速度越快越好 12 min內(nèi)從 196 ℃ 升溫至 37 ℃ （水浴鍋）。在使用該類冷凍保護(hù)劑時，需要一定的時間進(jìn)行 預(yù)冷 。 ? 常溫下 DMSO對細(xì)胞的毒副作用較大，在 4 ℃ 時，其毒副作用大為減弱，凍存時 DMSO平衡應(yīng)在 4 ℃ 下進(jìn)行。 復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶 ，即冰晶的重結(jié)晶。 ? 保存效果較好，但缺點是比較麻煩，不宜長時間運輸，多需空運，代價較大?？扛街诩?xì)胞表面的培養(yǎng)液，可使細(xì)胞短時間不受損。 培養(yǎng)物的準(zhǔn)備和固定前處理 各種細(xì)胞培養(yǎng)物。 1） Giemsa染色 染色步驟 （蓋片培養(yǎng)或涂片法）： 1） Sorensen buf和 Giemsa染液 9:1體積比混合即得到染色液 2）用甲醇固定細(xì)胞標(biāo)本 10 min，或醋酸 /甲醇 (1:3)固定 30 min 3）用滴管將染色液布滿材料面（不要有氣泡） 4）染色 1015 min，用自來水將玻片沖洗干凈，空氣干燥，二甲苯透明 5）光學(xué)樹脂膠封片后觀察 結(jié)果： 細(xì)胞核染成紫紅色或藍(lán)紫色，胞漿染成粉紅色 2）蘇木精 伊紅染色 ? 染液制備： 1）蘇木精染液 (20 ): 蘇木精 g，銨礬 (NH4)2SO4Al2(SO4)3 24g， H2O 50 ml， NaIO3 g，甘油 30 ml，冰醋酸 2 ml。 ? 染液配制： 用生理鹽水將 AO配成 1%的母液，冰箱保存，用時則 M的 PBS（ pH ）稀釋成 %工作液。 ? 構(gòu)造： 機(jī)械部分 /照明部分 /光學(xué)部分 光學(xué)顯微鏡的種類 反差方式 機(jī)制 說明 亮視野 反差取決于光吸收 常結(jié)合組織染色技術(shù)來提高反差 相差 將相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹? 反差與局部的相密度成正比，包括線粒體、染色體、溶酶體等 分光干涉相差 轉(zhuǎn)換通過樣品的光程相位差的變化率 光經(jīng)過細(xì)胞和細(xì)胞器邊緣時光程突然變化形成強(qiáng)烈反差 暗視野 散射光觀察 產(chǎn)生細(xì)胞和細(xì)胞器邊緣的輪廓圖像 干涉反射 反差取決于相互靠近的空間表面之間發(fā)生的衍射 用于觀察細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞與基底間的接觸帶 偏振光 在低于光學(xué)分辨率的情況下檢測具有雙折射性的超分子組織結(jié)構(gòu) 用于定性排列結(jié)構(gòu)的研究，如細(xì)胞骨架、有絲分裂的微管以及強(qiáng)韌纖維、膜的觀察 熒光 反差取決于熒光基團(tuán)的光吸收及光衍射 僅限于適當(dāng)?shù)淖园l(fā)熒光和熒光標(biāo)記 光學(xué)顯微鏡觀察的一般過程 普通光學(xué)顯微鏡 相差顯微鏡 熒光顯微鏡 暗視野顯微鏡 偏振光顯微鏡 干涉顯微鏡 掃描隧道顯微鏡 原子力顯微鏡 視頻顯微鏡 共聚焦顯微鏡 1）相差顯微鏡 調(diào)節(jié)： 1）將顯微鏡合軸，并把視野圈開大至與聚光器光闌邊緣一致 2）將與物鏡放大倍數(shù)一致的相板放入聚光器中 3）把調(diào)中目鏡換到目鏡筒中，旋動調(diào)中目鏡上的調(diào)焦環(huán)至相板相環(huán)的圖像清晰（分別是兩個明暗不同的圓形圖像） 4）調(diào)節(jié)聚光器上的相環(huán)調(diào)中旋鈕（注意不要旋動聚光器的調(diào)中紐），使兩個圓環(huán)圖像重疊成同心圓 5）用普通目鏡換下調(diào)中目鏡并觀察 1）相差顯微鏡 注意事項： 1）換不同倍率的物鏡時，要選用一致的相板和相環(huán)，并重新調(diào)中 2）載物片或培養(yǎng)瓶的表面要平整、均勻、干凈，標(biāo)本不能太厚，以免影響觀察效果 3）標(biāo)本要在有水的環(huán)境中（如培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)液、水封片等）成像效果才明顯 4）光路上最好加單色（如黃綠色）濾光片，使其分辨率達(dá)到最高 2）熒光顯微鏡 調(diào)節(jié)： 1）打開電源開關(guān)，當(dāng)電壓表的指針穩(wěn)定在 220 V時，打開高壓汞燈開關(guān)，預(yù)熱 10 min，移開光簾，光線進(jìn)入光路 2）將燈前鏡擺出光路，插入合適濾光片；把標(biāo)本放在載物臺上，選25 物鏡，調(diào)焦到成像；調(diào)節(jié)聚光器調(diào)中鈕使光圈圖像居中，然后恢復(fù)光圈到與視野等大 3）將燈前鏡擺入光路，撥動燈前鏡調(diào)焦桿，使燈影光斑清晰；調(diào)節(jié)燈泡調(diào)中鈕使燈影光斑居中，然后調(diào)節(jié)反射鏡調(diào)中鈕，使反射影光斑居中；最后將燈前鏡擺出光路，即可觀察樣品 2）熒光顯微鏡 注意事項： 1）觀察對象必須是自發(fā)熒光或已被熒光染料染色的標(biāo)本 2）載物片、蓋玻片及鏡油應(yīng)不含自發(fā)熒光雜質(zhì) 3）選用效果好的濾光片 4）熒光標(biāo)本很易褪色，操作、觀察要迅速 5）啟動高壓汞燈后，不得在 15 min內(nèi)將其關(guān)閉；關(guān)閉后，必須待汞燈冷卻后方可再次打開 6）若暫不觀察標(biāo)本，可用阻光光簾阻擋光線，以保護(hù)標(biāo)本 7）若常時間觀察熒光標(biāo)本最好戴護(hù)目鏡 3）暗視野顯微鏡 調(diào)節(jié)： 1）按調(diào)節(jié)普通顯微鏡方法調(diào)節(jié)好后，換上暗視野聚光器和被檢標(biāo)本片 2）調(diào)節(jié)聚光器和物鏡的上下工作距離，看到標(biāo)本的圖像 3）調(diào)節(jié)聚光器的上下軸和中軸，在視野清晰的前提下，背景越暗越好 4）把燈泡亮度、視野光圈和聚光器的孔徑光圈開到最大，此時暗視野效果最佳 3）暗視野顯微鏡 注意事項： 1）聚光器與物鏡的數(shù)值孔徑應(yīng)合理匹配，物鏡的數(shù)值孔徑必須小于聚光器的數(shù)值孔徑 2）蓋玻片和載物片應(yīng)清潔無痕，否則，會出現(xiàn)明亮的散射光影響觀察 3）必須在聚光鏡和載片之間加香柏油，以維持暗視野和保證觀察效果 4）激光共聚焦掃描顯微鏡 激光共聚焦掃描顯微系統(tǒng)由一個激光掃描顯微鏡在物鏡的成像面上加一個針孔
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