【正文】 抑制劑處理細(xì)胞，使細(xì)胞滯留在 DNA合成前期，當(dāng)解除抑制后，即可獲得處于同一細(xì)胞周期 (G1)的同步化細(xì)胞。 分選法 ? 依據(jù)：細(xì)胞體積大小 ? 方法 –常規(guī)分選方法是梯度離心 –精細(xì)的分選可采用流式細(xì)胞儀 ? 優(yōu)點 –操作簡單 –分選細(xì)胞維持了自然生長狀態(tài)，不會有其它處理帶來的副作用 ? 缺點 –分選精細(xì)度較差 低溫處理 ? 可以提高培養(yǎng)體系中細(xì)胞同步化的程度 –Okamura等曾采用此方法使胡蘿卜懸浮細(xì)胞較好地同步化。 單細(xì)胞分離方法 ? 酶解法 –酶對細(xì)胞壁有一定的軟化作用，所以采用酶法時，必須加入甘露醇等滲透壓保護(hù)劑；可通過加入硫酸葡聚糖鉀來提高游離細(xì)胞的產(chǎn)量。 –單細(xì)胞懸浮液的制備：分離的單細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)基洗滌 2次以后，調(diào)整密度為 5 103個 /毫升 –植板：將 1份已調(diào)整好密度的單細(xì)胞懸浮液與 4份 35℃ 的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻地平鋪于培養(yǎng)皿中，其厚度為 5mm左右。 ②由于它具有篩選效率高、篩選量大、操作簡便等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分裂、分化、生理生化、遺傳變異、次生代謝產(chǎn)物合成等。 ? 缺點：不能在顯微鏡下追蹤細(xì)胞分裂、生長過程。 ? 細(xì)胞起始密度： 30～ 80個 /室。 ? 固定化植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)要進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)有許多問題尚待解決 。 Flash 植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng) ? 規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立 ? 生 物 反 應(yīng) 器 ? 規(guī)?；囵B(yǎng)的技術(shù)問題 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)要求 ? 從工程的角度講必須要進(jìn)一步研究和開發(fā)適宜于植物生長和生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，建立最佳的控制和調(diào)節(jié)系統(tǒng)； ? 從培養(yǎng)技術(shù)方面講必須滿足以下三個條件： –培養(yǎng)的細(xì)胞在遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物。 種子細(xì)胞選擇 ? 高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選 –懸浮細(xì)胞系 –單細(xì)胞克隆 –種細(xì)胞增殖 種子細(xì)胞增殖與放大培養(yǎng) ? 目的 –準(zhǔn)備材料 –提供技術(shù)參數(shù) ? 過程 –搖瓶 –反應(yīng)器 大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立 ? 培養(yǎng)方式 –成批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和半連續(xù)培養(yǎng)。 ? 適合植物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器應(yīng)該具有適宜的氧傳遞、良好的流動性和較低的剪切力。 Flash 固定化反應(yīng)器 ? 特點： –較容易地控制培養(yǎng)系統(tǒng)的理化環(huán)境，可以研究特定的代謝途徑，便于調(diào)節(jié)。 –包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽和聚丙烯酰胺等 –附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫和中空纖維等。其平均直徑比細(xì)菌大幾十倍 –通常以 2～ 200個細(xì)胞，直徑 2mm大小的非均勻小細(xì)胞團(tuán)形式存在。 ?長春花細(xì)胞培養(yǎng)密度在 10g/L時，培養(yǎng)液粘度有賴于細(xì)胞年齡、形態(tài)和細(xì)胞團(tuán)大小。 ?溶氧濃度：毛地黃細(xì)胞培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基氧濃度從 10％飽和度上升至 30％，細(xì)胞生長速率從 ，如果繼續(xù)上升至 40％ ，細(xì)胞生長速率反而下降至 。 產(chǎn)生等于或高于親本植物藥物含量的植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) 植物種類 培養(yǎng)類型 化合物 含量（％）干重 化合物 植物 人參 愈傷 人參糖苷 27 海巴戟 懸浮 蒽醌 18 洋紫蘇 懸浮 迷迭香酸 16 紫草 懸浮 紫草寧 14 12 唐松草 懸浮 小檗堿 10 日本黃連 懸浮 小檗堿 10 24 蓬子菜 懸浮 蒽醌 豬殃殃 懸浮 蒽醌 煙草 愈傷 煙堿 優(yōu)化培養(yǎng)基 ? 選擇合適培養(yǎng)基種類及植物生長調(diào)節(jié)劑 – 桅子 －－ 藏紅花酸－－ 心臟病 ?B5， MG5利于細(xì)胞生長 ?M9利于黃色素合成 （ 鐘青平等 1994） – 高山紅景天－－紅景天苷－－ 抗疲勞、抗缺氧 ?NAA。 ? 10%椰乳 ， 能明顯促進(jìn)滇紫草愈傷組織紫草素的產(chǎn)生 ， 其紫草素的含量是對照的 24倍 (周立剛等 1991)。 （陳永勤等 2022） – 磷 ?促進(jìn)長春花細(xì)胞生長 ?抑制吲哚生物堿合成 (周立剛等， 1991） ?其它元素 – 高濃度的 Co2+和 Fe2+有利于花青素的積累（杜金華等， 1997） – CaCl2和 MgSO4，能明顯提高蘿芙木咖啡堿的含量 – 在紫草細(xì)胞培養(yǎng)中，紫草素的含量明顯受到 Ca2+濃度的影響 （ Fujita et al. 1981） – Cu2+可能對梔子黃色素的產(chǎn)生有促進(jìn)作用，（鐘青萍等， 1994） 提高植物細(xì)胞藥物產(chǎn)量的途徑 ? 前體（ precursor）的應(yīng)用 –作用：提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量。過量也可能產(chǎn)生反饋抑制。 –非生物激發(fā)子，如輻射、金屬離子、茉莉酸類似物（茉莉酸甲酯， MJA）等。 ? 寡糖素 有利于人參和西洋參的細(xì)胞生長和皂甙的積累 ? 酵母提取物 促進(jìn)生物堿、黃酮類合成 – 在長春花、葛和茶等多種植物細(xì)胞培養(yǎng)中已成功應(yīng)用 提高植物細(xì)胞藥物產(chǎn)量的途徑 提高植物細(xì)胞藥物產(chǎn)量的途徑 ? 非生物激發(fā)子 激發(fā)子對南方紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)合成紫杉醇的影響 激發(fā)子 適宜濃度（ mM） 與對照比提高產(chǎn)物效率（倍） MJA 花生四烯酸 硝酸柿胺 水楊酸 硝酸鹽 MJA Mg/L 提高植物細(xì)胞藥物產(chǎn)量的途徑 ? 抑制劑的使用 – 雙氯苯咪唑和氯化膽堿 －－ 固醇生物合成抑制劑 ?可使青蒿素合成量明顯提高。 提高植物細(xì)胞藥物產(chǎn)量的途徑 ? 兩相培養(yǎng) –組成：培養(yǎng)相和提取相組成 –類型：液 液系統(tǒng)和液 固系統(tǒng) –液 液系統(tǒng)：分離相主要使用液體石蠟、烷類化合物。 ? 接種量 :10g (鮮重 )/100ml培養(yǎng)基 /250mL 三角燒瓶。如在條葉龍膽愈傷組織中，龍膽著含量較低，而根的分化可以提高龍膽苦苷的含量 –發(fā)狀根（毛狀根， hairy root）培養(yǎng)生產(chǎn)次生產(chǎn)物，已在人參、丹參、紫草、顛茄和黃芪等植物中進(jìn)行了探索性研究，并取得良好進(jìn)展。 1934年， Hildebrand 報道了發(fā)根農(nóng)桿菌感染蘋果樹產(chǎn)生發(fā)根 生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素 ? 青蒿：為雙子葉植物藥菊科植物 ? 青蒿素： ?倍半萜內(nèi)酯類化合物 ?功效：治療瘧疾 , draught cylinder, stell mesh, outlet, , nozzle, , inlet, filter, , 11. Holes on draught cylinder, valve, storage tank, device, 15. 40W fluorescent lamp 生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素 Growth feature of Artemisia annua adventitious shoot in the mist bioreactor (a) 0 d 。 ? 3. 反應(yīng)器培養(yǎng) – 12 h／ d培養(yǎng)， 25177。 最大生物量 ，青蒿素產(chǎn)量達(dá)到，青蒿素的含量為 ％。 小結(jié) ? 細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)有可能成為新型生化工業(yè)的重要途徑，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)的基礎(chǔ)。 思考題 1．一個好的懸浮細(xì)胞系有哪些特征？用于建立懸浮細(xì)胞系的愈傷組織有何要求？ 2．建立懸浮細(xì)胞系的關(guān)鍵技術(shù)有哪些？ 3．懸浮細(xì)胞系在繼代培養(yǎng)中其群體生長規(guī)律 4．細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)有哪些培養(yǎng)系統(tǒng)？ 5．植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)與次生產(chǎn)物生產(chǎn)前景及需要研究解決的問題。 細(xì)胞大量培養(yǎng) ? 反應(yīng)器 ： 2L 機(jī)械攪拌式，工作體積 。 ? 培養(yǎng)條件 ：設(shè)置好通氣速率和攪拌轉(zhuǎn)速，溫度自動控制在（ 25177。 ? 反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞的最適接種量高于搖瓶的最適接種量（搖瓶一般為 ～ /L)。 4 糖利用動態(tài)變化過程 ? 在培養(yǎng)的當(dāng)天，初始蔗糖濃度有所降低，這是因為小部分初始蔗糖經(jīng)過高溫滅菌能分解為葡萄糖和果糖。 5 聚集體分布 ? 反應(yīng)器內(nèi)聚集體分布隨培養(yǎng)進(jìn)程而發(fā)生變化 – 12mm的聚集體含量在培養(yǎng)后期明顯增加，而 23mm的聚集體含量卻相應(yīng)減少。 培養(yǎng)一段時間細(xì)胞濃度增加后，進(jìn)行繼代培