細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)技術(shù)ppt課件-在線瀏覽
2025-06-20 03:43本頁面
【正文】 培養(yǎng)后可貼壁或懸浮生長，在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。 ? 細(xì)胞系 cell line 原代培養(yǎng)物成功傳代后，則稱之為細(xì)胞系。無限細(xì)胞系大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細(xì)胞，因此本質(zhì)上已是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。通常將具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的細(xì)胞群稱為細(xì)胞株。此時細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。細(xì)胞株平均在 10分鐘一 4小時貼壁。 ? 進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有 生長基質(zhì) （化學(xué)合成的功能基團(tuán)） 潛伏期 ? 此時細(xì)胞有生長活動，而無細(xì)胞分裂。 對數(shù)生長期： ? 細(xì)胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進(jìn)行實驗研究。一個細(xì)胞克隆中的所有細(xì)胞均來源于同一個祖先細(xì)胞。 CO2培養(yǎng)箱 ? CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為 37 ℃ ， 5％ CO2 。 ②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。 ③箱內(nèi)置 46 L蒸餾水，加入 100ml飽和硫酸銅溶液，以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)，并抑制真菌污染。 ? 胰蛋白酶液濃度 越高 ， 作用越強 ， 但超過一定限度會損傷細(xì)胞 。 用濾器過濾除菌 。 ? 用含血清培養(yǎng)液終止其對細(xì)胞的消化作用 培養(yǎng)基 ? 培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基，如 TC19 MEM、 RPMI16 DMEM等。 血清中含有： ? 多種蛋白質(zhì) （ 白蛋白 、 球蛋白 、 鐵蛋白等 ） ? 多種金屬離子 ? 激素 ? 促貼附物質(zhì) ， 如纖粘蛋白 、 冷析球蛋白 、 膠原等 ? 各種生長因子 ? 轉(zhuǎn)移蛋白 ? 不明成分 ? 一般說來 ， 含 5％ 小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死 ， 但支持細(xì)胞生長一般需加 10％ 血清 。 ? 優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。 ? 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。 ? 慶大霉素：每毫升 100單位 —— 方便、廣譜、穩(wěn)定 完全培養(yǎng)基的組成 ? 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80％一 95％ ? 血清 5％一 20％ ? 碳酸氫鈉 g/L ? 青、鏈霉素 各 100單位／毫升 細(xì)胞培養(yǎng)基本方法（無菌原則） ? 無菌工作臺用 75%酒精擦拭干凈，紫外線照射 40分鐘以上。 ? 操作時注意無菌臺內(nèi)空間層次。手及物品不要在暴露的瓶口上方來往，嚴(yán)格注意無菌操作。 ? 懸浮生長細(xì)胞傳代 離心法傳代：離心（ 1000轉(zhuǎn) /分 ）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 ? 貼壁生長細(xì)胞傳代 采用酶消化法傳代。 貼壁生長細(xì)胞傳代方法 ? 吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液 ? 適量 PBS洗凈殘留培養(yǎng)液 ? 加入 12 ml ％的胰蛋白酶液 (以消化液能覆蓋整個瓶底為準(zhǔn)） ? 靜置 210 min（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測） ? 加入培養(yǎng)液，終止胰酶消化作用 ? 用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液 ? 吸取 1/3細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi) ? 加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi) ? 將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 ? 細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。 凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融 ? 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 ? 復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。 低溫保護(hù)劑的應(yīng)用 ? 在細(xì)胞凍存時加入低溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。 細(xì)胞凍存方法 ? 預(yù)先配制凍存液： 含 20%血清培養(yǎng)基 ? 10% DMSO ? 取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消
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