【正文】 養(yǎng)基 ： 1950年 Man等為培養(yǎng)雞胚組織設(shè)計(jì) , 含有 60種成分 ,為全面培養(yǎng)基 ,廣用于各類細(xì)胞培養(yǎng)。簡(jiǎn)單、便于添加 ,適于各種傳代細(xì)胞系和特殊研究用 ,在此基礎(chǔ)上改良的有 : （ MEM、 DMEM 、 IMEM ）　　 McCoy5A培養(yǎng)基 ： 1959年 MeCoy為肉瘤細(xì)胞設(shè)計(jì)，BSS＋ 40種成分 , 尤對(duì)原代和難于培養(yǎng)細(xì)胞較好。 F10適用于倉(cāng)鼠、人二倍體細(xì)胞 ,特適于羊水細(xì)胞培養(yǎng)。平衡鹽水pH值調(diào)整液細(xì)胞消化液抗生素溶液? 無(wú)血清培養(yǎng)基 (serum來(lái)源： 已知成分，關(guān)鍵是補(bǔ)充生長(zhǎng)因子和激素；胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白幾乎是所有細(xì)胞株必須的。常用： NCTC13 SFRE1991已商品化上市。中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞培養(yǎng)專用無(wú)血清培養(yǎng)基（ CHOCultureTherapyCulture三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法? 天然培養(yǎng)基? 合成培養(yǎng)基? 無(wú)血清培養(yǎng)基? 其他常用液：特點(diǎn)：維持滲透壓、控制酸堿平衡 ,提供能量和無(wú)機(jī)離子、配培養(yǎng)用液基礎(chǔ)液、 細(xì)胞洗滌液。常用： Hanks液緩沖能力較弱；磷酸緩沖液成分簡(jiǎn)單，也較常用。平衡鹽水pH值調(diào)整液細(xì)胞消化液抗生素溶液pH值調(diào)整液：需要單獨(dú)配，單獨(dú)滅菌， 4度低溫保持，培養(yǎng)基滅菌后使用前加入，如過(guò)量用滅菌的 10％醋酸或通人 CO2調(diào)整。% 、 % 、 % 的 NaHCO3溶液；HEPES液（二羥乙基哌嗪乙烷磺酸）緩沖能力強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒。平衡鹽水pH值調(diào)整液細(xì)胞消化液抗生素溶液細(xì)胞消化液：細(xì)胞培養(yǎng)前用消化液把組織塊解離成分散細(xì)胞或傳代培養(yǎng)時(shí)使貼壁細(xì)胞分散解離。胰蛋白酶溶液 ：能水解細(xì)胞間的蛋白質(zhì)。? EDTA溶液 （ Versen）： 對(duì)細(xì)胞有非酶性解離作用。消化新鮮組織時(shí)，常將上述二者以一定比例混合（ 1： 1或 1： 2），效果更佳。平衡鹽水pH值調(diào)整液細(xì)胞消化液抗生素溶液抗生素溶液：常用適量的抗生素，以防止微生物污染：? 常溶于 Hanks液配成母液，最終濃度為 100U/ml青霉素和 100ug/ml鏈霉素。常溶于 Hanks液配成母液，最終使用濃度為 50ug/ml。制成 5000U/ml的懸液，使用時(shí)最終濃度為 25U/ml。材料的選取v細(xì)胞培養(yǎng)v： 冷凍保存，超低溫（－ 196℃ ）的液氮根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有 3種：1． 貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代? 采用酶消化法傳代。2． 懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代? 離心法傳代：離心（ 1000轉(zhuǎn) /分 ）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。3．半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（ Hela細(xì)胞）? 貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)方法微載體微導(dǎo)管貼壁材料生長(zhǎng)階段固定化培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)216。霉菌性： 霉菌污染可見菌絲體。細(xì)胞交叉污染216。支原體無(wú)細(xì)胞壁，形態(tài)呈高度多形性，最小直徑 ， 可通過(guò)濾器。目前通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi) 100余株 /系細(xì)胞的檢測(cè)，污染率達(dá) 30%60%從國(guó)外引進(jìn)細(xì)胞株 /系也經(jīng)常出現(xiàn)支原體的污染。的合成及急速消耗培養(yǎng)基中的氨基酸來(lái)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，并能降低細(xì)胞的融合率 ， 干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （ b） .低張?zhí)幚淼匾录t染色法； （ c） .熒光染色法 ；熒光染色法 （ Hoechst33258） 顯示染色體，細(xì)胞周圍亮點(diǎn)為支原體掃描電鏡法顯示支原體，附于細(xì)胞表面眾多的圓形顆粒為支原體　 ：關(guān)鍵是正確處理洗消器皿用具。加溫處理；體內(nèi)外巨噬細(xì)胞凈化消除。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)是指在人工條件下，在生物反應(yīng)器(bioreater)培養(yǎng)系統(tǒng)高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)生物制品，再通過(guò)相關(guān)的純化手段濃縮純化其產(chǎn)物的技術(shù)。對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，二硫鍵多，并且翻譯后的修飾對(duì)蛋白活性的影響很大的蛋白，采用原核表達(dá)系統(tǒng)往往不能滿足蛋白表達(dá)的需要216。216。為何還要構(gòu)建以哺乳動(dòng)物為代表的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)呢？：乙肝疫苗、狂犬疫苗、脊椎灰質(zhì)炎疫苗實(shí)例? 乙肝基因工程 (CHO)疫苗 :用基因工程技術(shù)將乙型肝炎表面抗原基因片段重組到中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)內(nèi)，通過(guò)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)增殖，增殖分泌乙肝表面抗原 (HBsAg)于培養(yǎng)液中，經(jīng)純化后制成。干擾素（ IFN)、 白細(xì)胞介素（ IL）、 B細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ BCGF）、 巨噬細(xì)胞激活因子（ MAN） 等英國(guó) Welle公司采用 8000L英國(guó) Celltech公司用氣升式生物反應(yīng)器生 α、 β和 γ干擾素；干擾素 是一種在同種細(xì)胞上具有廣譜抗病毒活性的蛋白，具有抑制病毒的作用，但不能殺滅病毒。作用機(jī)制：作用于細(xì)胞后使細(xì)胞產(chǎn)生多種其他蛋白，從而阻斷病毒復(fù)制過(guò)程。 MCAB：雜 交瘤 細(xì) 胞可在體外培養(yǎng)或移植到體內(nèi)條件下分泌大量 單 克隆抗體 。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)單克隆抗體是一種經(jīng)濟(jì)、可靠的途徑。 使之接近于人類抗體的天然結(jié)構(gòu)，從而消除了 ） 癌胚抗原 (CEA)是首先在結(jié)腸癌病人的血清中發(fā)現(xiàn)的一種球蛋白，在胎兒 3－ 6個(gè)月的血清中可以檢測(cè)到，所以稱作癌胚抗原。目前我國(guó)批準(zhǔn)上市的哺乳動(dòng)物細(xì)胞尤其是CHO細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)品很少，只有 促紅細(xì)胞生成素 （ EPO）、 CHO基因工程 乙肝疫苗 、以及 治療性抗體藥物 益賽普 （有效成分相當(dāng)于美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)的 Enbrel） 和 泰欣生 （ 有效成分相當(dāng)于美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)的 Erbitux） 等少數(shù)幾種生物技術(shù)藥物；現(xiàn) 狀? 哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)百泰的發(fā)酵系統(tǒng)由瑞士制造? 生物反應(yīng)器? 反應(yīng)器工藝流程? 發(fā)展趨勢(shì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)依據(jù)生物反應(yīng)器種 類 ： 浮培養(yǎng)用反 應(yīng) 器：如 攪 拌反 應(yīng) 器 、中空 纖維 反 應(yīng) 器、陶 質(zhì) 矩形通道蜂 窩 狀反 應(yīng) 器、 氣升式反 應(yīng) 器； 壁培養(yǎng)用反 應(yīng) 器：如 攪 拌反 應(yīng) 器（微 載 體培養(yǎng)）、玻璃珠床反 應(yīng) 器、中空 纖維 反 應(yīng) 器、陶 質(zhì) 矩形通道蜂 窩 狀反 應(yīng) 器； 應(yīng) 器：如流化床反 應(yīng) 器、固化床反 應(yīng) 器。culture） culture）? 半連續(xù)培養(yǎng) （ semicontinuousculture）? 灌流式 （ perfusionculture） ：一次性轉(zhuǎn)入 生物反應(yīng)器 ， 在培養(yǎng)過(guò)程中體積不變，不添加其它成分，一次性收獲細(xì)胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基。?直 觀 反映 細(xì) 胞生 長(zhǎng) 代 謝 的 過(guò) 程；?可直接放大。 常用攪拌式生物反應(yīng)器分批式培養(yǎng)單抗 ,采用微囊或巨載體培養(yǎng)。 美國(guó) Genentech使用 CHO細(xì)胞以 12,000L培養(yǎng)槽生產(chǎn) tPA重組蛋白以及治療癌癥的生物藥物 組織型纖維 蛋白 溶酶原激活物 (tPA)和 重組 型纖維 蛋白 溶酶原激活物 (rtPA). 特點(diǎn)：? 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，總密度較高，產(chǎn)物濃度較高。? 可采用工藝參數(shù)的直接放大。是當(dāng)前主流優(yōu)勢(shì)的培養(yǎng)工藝，關(guān)鍵技術(shù)是基礎(chǔ)培養(yǎng)基和流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。半連續(xù)式培養(yǎng) ： 懸浮培養(yǎng)形式 ， 每間隔一段時(shí)間，從中取出部分培養(yǎng)物，再用新的培養(yǎng)液補(bǔ)足到原有體積，使反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變。? 可進(jìn)行多次收獲 ， 長(zhǎng)時(shí)期進(jìn)行生產(chǎn)；? 細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長(zhǎng)，并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞在一較高的濃度水平，培養(yǎng)過(guò)程可延續(xù)到很長(zhǎng)時(shí)間。連續(xù)式培養(yǎng) ：●細(xì)胞維持持續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)； ●可控制衰退期與下降期。灌流式 :培養(yǎng)過(guò)程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。? 國(guó)際上， Genzyme， GeicInstitute，Bayer(德國(guó) )等公司都采用 連續(xù) 灌流工 藝 。（ 第四軍醫(yī)大學(xué)）國(guó)家８６３計(jì)劃唯一的細(xì)胞工程基地，是我國(guó)專業(yè)性的細(xì)胞工程中試基地，主要研究和發(fā)展動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工程技術(shù)，雜交瘤細(xì)胞－單抗、工程細(xì)胞－細(xì)胞因子的質(zhì)控和中試，以及肽類藥物、重組蛋白的研究與中試等。國(guó)家八六三計(jì)劃生物工程技術(shù)主題專家，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)專家，中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)腫瘤標(biāo)志專業(yè)委員會(huì)副主任委員；? 2022年，發(fā)現(xiàn)了３個(gè)對(duì)ＳＡＲＳ病毒有明確抑