核酸探針技術(shù)及應(yīng)用-在線瀏覽
2024-09-09 22:49本頁面
【正文】 li)，篩選含特異目的基因片段的克隆株進(jìn)行擴(kuò)增，再提取基因片段作探針。也可以進(jìn)一步克隆在大腸桿菌中進(jìn)行無性繁殖，再從重組質(zhì)粒中提取CDNA作探針。另一種是從CDNA 衍生而來的RNA探針， 可由很強(qiáng)的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄而得。1．4 寡核苷酸探針用DNA合成儀可以合成50個核苷酸以內(nèi)的任意序列的寡核苷酸片段， 以此作為核苷酸探針，也可將它克隆到M13系統(tǒng)中使之釋放含探針序列的單鏈DNA，使探針的制備和標(biāo)記簡化。同位素的選擇是依檢測類型而定，制就的DNA探針先經(jīng)加熱變性成單鏈后再與固定于硝酸纖維素膜上的待測DNA雜交，如為同源則與之結(jié)合，經(jīng)放射自顯髟后，膜上出現(xiàn)黑色區(qū)。其缺點(diǎn)是半衰期短，費(fèi)用昂貴，同時需防護(hù)設(shè)備，另外放射自顯影時問較長。 和酶等，應(yīng)用較多的是生物素?？梢杂枇匣瘜W(xué)發(fā)光物標(biāo)記技術(shù)和均相雜交技術(shù)相結(jié)合可能是未來核酸探針分析技術(shù)的發(fā)展方向。每個生物素分子由四個相同亞基組成，每個亞基都能專一性地識別一個生物素分子的脲基環(huán)部分。利用生物素和親和素專一結(jié)合的特點(diǎn)，加入與熒光物質(zhì)或酶相偶聯(lián)的親和素，去尋找被生物素所標(biāo)記的目標(biāo)，然后檢測熒光或酶反應(yīng)而檢待測目標(biāo)。提取DNA可用DNA提取儀，它是用一支包裝的小柱于30分鐘內(nèi)快速提取DNA的儀器。目前已發(fā)展了不需抽提核酸而直接在細(xì)胞裂解液中進(jìn)行檢測的方法。樣品處理要考慮的另一個問題是待測樣品中目的序列的含量或總的核酸量。解決的辦法是用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法，它能在體外通過DNA 聚合酶將目的序列的拷貝數(shù)特異地快速擴(kuò)增1O5～107倍，使標(biāo)本中目的序列的含量大為提高，便于檢測。4 核酸分子雜交核酸分子雜交(nucleic acid bybridization)是指標(biāo)記的單核苷酸和所需檢測的目的單鏈核酸通過堿基配對互相結(jié)合的過程。雜交程序的發(fā)展經(jīng)歷了由固相到液相再到均相雜交的過程。液相雜交不需要固相雜交那樣經(jīng)過電泳分離和固定待測序列，而是在溶液中探針與目的序列雜交再通過固相捕獲分離雜交體進(jìn)行檢測。4．1固相雜交固相雜交是將欲檢測的核酸樣品先結(jié)合到某種固相支持物上，再與溶解于溶液中的雜交探針進(jìn)行反應(yīng)。從目前雜交技術(shù)的發(fā)展情況看，固相雜交技術(shù)發(fā)展較迅速，而且應(yīng)用范圍更加廣泛。此法包括了DNA 轉(zhuǎn)移雜交法(Southern印跡法)和RNA轉(zhuǎn)移雜交(Northern印跡法)。此法不僅敏感特異而且可通過放射自顯影直接觀察血清或組織中病毒DNA桉酸片段分子量的大小。其原理是與DNA轉(zhuǎn)移雜交相似，不同的是RNA轉(zhuǎn)移雜交是在變性劑存在下進(jìn)行凝膠電泳分離RNA或mRNA，變性劑是防止RNA 分子二級結(jié)構(gòu)發(fā)生卡環(huán)的形成，保持其單鏈線型狀態(tài)。 通過狹縫印跡(Slot blot)、Soutbern blot、Northem blot或轉(zhuǎn)種點(diǎn)膜
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