【正文】 ystem with low toxicity.KEY WORDS: Lactoferrin。 Coumarin6。 Brain delivery 血腦屏障（BBB）在保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受外源性毒物損傷的同時(shí)也限制了大多數(shù)神經(jīng)治療藥物入腦，成為腦部疾病治療的最大障礙[1]。隨著現(xiàn)今腦部疾病發(fā)病率的不斷升高，通過(guò)各種給藥系統(tǒng)和靶向策略增加藥物的腦內(nèi)傳遞已成為解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵。而非侵入給藥借助BBB上存在的內(nèi)源性物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可以避免破壞血腦屏障并實(shí)現(xiàn)廣泛的全腦遞藥[4]。目前最具代表性的受體介導(dǎo)腦內(nèi)遞藥系統(tǒng)OX–26結(jié)合的免疫脂質(zhì)體成功用于小分子藥物及基因藥物的腦內(nèi)遞送，證實(shí)了受體介導(dǎo)途徑優(yōu)良的腦內(nèi)遞藥能力[6, 7]。因此，腦部疾病的治療仍需開發(fā)新型的腦內(nèi)遞藥系統(tǒng)。Lf具有抗炎，免疫調(diào)節(jié)，抗菌及抗癌等多種生理功能[11]。最近, Ji等人比較了Tf，OX26和Lf的入腦性能，結(jié)果證實(shí)Lf的入腦能力顯著高于前兩者[15]。采用聚乙二醇聚乳酸納米粒與Lf連接是基于納米粒相對(duì)于脂質(zhì)體的諸多優(yōu)點(diǎn)：具有較好的穩(wěn)定性，處方中輔料種類較少，制備相對(duì)簡(jiǎn)單，具有一定的緩釋能力便于慢性疾病的治療[16]。為了評(píng)價(jià)其腦內(nèi)遞藥特性，以香豆素6為熒光探針定性和定量地研究了小鼠腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)LfNP和NP的攝取及它們?cè)谛∈竽X內(nèi)的分布,并通過(guò)細(xì)胞活力試驗(yàn)進(jìn)行了該系統(tǒng)體外毒性的評(píng)價(jià)。乳鐵蛋白（Sigma, 美國(guó)）；MPEG（Mr 3000，SUNBRIGHTTM MEH30H，NOF，日本）；MaleimidePEG（Mr 3400，NEKTAR，美國(guó)）；Traut’s試劑（Sigma，美國(guó)）；山羊抗Lf抗體（Bethyl，美國(guó)）；10 nm 膠體金標(biāo)記兔抗山羊IgG抗體（Sigma，美國(guó)）；Lf ELISA試劑盒（Bethyl，美國(guó)）；HiTrap脫鹽柱（Amersham Pharmacia Biotech AB，瑞典）；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清（Gibco，美國(guó)）；熒光封片劑（Dako，美國(guó)）；香豆素6（Aldrich，德國(guó)）；CCK8（Dojindo Laboratories，日本）； BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海申能博彩公司，中國(guó)）；昆明鼠（1820 g，♂，復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部）。Lf 與Traut’s試劑1：40反應(yīng)后以HiTrap脫鹽柱進(jìn)行純化。成初乳前有機(jī)相中加入香豆素6，制備載香豆素6的 NP和LfNP，以Sepharose CL4B除去未包封的香豆素6。以免疫電鏡技術(shù)和X射線光電子能譜對(duì)LfNP表面連接的Lf進(jìn)行驗(yàn)證?？疾燧d香豆素6的LfNP和NP在pH pH 。細(xì)胞用HBSS預(yù)先孵育15 min后，分別加入載香豆素6 LfNP和NP的HBSS溶液（15 μg/ml），37℃ h、1 h和2 h。同時(shí)將載香豆素6的LfNP和NP分別以10 μg/ml的濃度加入培養(yǎng)孔中，放入37℃、2和4 h，考察在37℃下、。試驗(yàn)結(jié)束后，棄去納米粒溶液，細(xì)胞用1 ml冰冷的PBS終止攝取，再用PBS 1ml沖洗5次。采用HPLC法測(cè)定溶解液中香豆素6的濃度，以BCA法測(cè)定蛋白濃度。分別加入樣品濃度為0－ mg/ml 的Lf、NP和LfNP的PBS溶液，37℃孵育4 h，溶液用110 μl 新鮮的培養(yǎng)液（含CCK8 10 μl）替換，37℃孵育4 h。以培養(yǎng)液為對(duì)照，計(jì)算細(xì)胞活力。54只小鼠平均分成2組，每組分別尾靜脈注射載香豆素6的LfNP和NP溶液（%和0. 71%） 60 mg/kg，1，2，4，8，12和24 h摘眼球取血后處死，迅速取出大腦去除腦膜上的血管，稱重后20℃保存。樣品處理后以HPLC法分析血中和腦中的香豆素6含量。由各時(shí)間點(diǎn)三個(gè)樣本的平均藥物濃度經(jīng)劑量校正后對(duì)相應(yīng)的時(shí)間作圖，得藥時(shí)曲線，梯形法計(jì)算藥時(shí)曲線下面積（AUC0t）。3. 結(jié)果 NP和LfNP的表征透射電鏡下觀察，制得的NP和LfNP大小均勻、外觀圓整，粒徑分別為（ 177。 ）nm。ELISA測(cè)得每個(gè)LfNP表面約有（55177。體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明載香豆素6的LfNP和NP在pH pH %，因此，香豆素6可以作為熒光探針示蹤納米粒。 B Lf–NP。 D Lf–NP only stained with 10nm colloidal gold labeled rabbit antigoat IgG。兩種納米粒37 186。C，呈溫度依賴性（圖2A）。C時(shí)，兩種納米粒攝取量隨濃度的升高呈線性升高（圖2A），具有濃度依賴性，在60 μg/ml時(shí)。兩種納米粒的攝取呈時(shí)間，溫度和濃度依賴性，為主動(dòng)內(nèi)吞過(guò)程。攝取抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入過(guò)量的Lf后（10 mg/ml）后，LfNP的攝取被抑制到與NP相近的水平，證實(shí)了LfNP能夠通過(guò)Lf介導(dǎo)的內(nèi)吞方式被攝取。C，給予相同濃度的LfNP和NP后， 細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間的推移而增強(qiáng)，在30min，1h和2h， LfNP組的熒光均顯著強(qiáng)于NP組。Lf，LfNP和NP的CCK8試驗(yàn)結(jié)果表明，與Lf及NP相似，LfNP對(duì)細(xì)胞活力無(wú)顯著影響，在給予LfNP 3mg/ml后細(xì)胞活力依然大于80%（圖4）。C和4 186。C孵育不同時(shí)間后的攝取情況；C10 μg/ml NP, Lf–NP和加入10 mg/ml Lf的Lf–NP在37 186。C and 4 186。 B 10 μg/ml Lf–NP and NP at 37 186。 C 10 μg/ml NP, Lf–NP and Lf–NP with 10 mg/ml Lf at 37 186。C μg/ml LfNP和NP的熒光顯微鏡照片，G和H中標(biāo)尺為50 181。mA/I h；D/L h；B/J NP孵育1 h；E/M LfNP孵育1 h；C/K NP孵育2 h；F/N LfNP孵育2 hFig. 3 Fluorescent microscopy photographs of cells exposed to 15 μg/ml Lf–NP and NP at 37 186。m. Inserts G and H are of greater magnification. The magnification bar is 50 181。 . n=3. LfNP腦內(nèi)遞藥特性的體內(nèi)評(píng)價(jià)小鼠大腦冰凍切片的熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明在第三腦室室周區(qū)，皮層和紋狀體（圖 5B, D 和F）LfNP的分布顯著高于NP (圖5A, C和E)。LfNP特定的濃集于紋狀體和第三腦室室周區(qū)，這一特點(diǎn)可以用于治療帕金森病，肥胖等靶點(diǎn)位于此部位的疾病。Lf的引入增加了納米粒在腦內(nèi)的濃集，這可能是連接在表面的Lf通過(guò)其在BBB上的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)增加了納米粒入腦。圖5 尾靜脈注射60 mg/kg LfNP和NP1h后的腦內(nèi)分布，標(biāo)尺為50 181。m.A periventricular region of the third ventricle after NP administration。 C cortex after NP administration。 E striatum region after NP administration F striatum region after LfNP administration圖6小鼠尾靜脈注射60 mg/kg納米粒后血和腦中的香豆素6