乳鐵蛋白結(jié)合聚乙二醇聚乳酸納米粒腦內(nèi)遞藥特性-全文預(yù)覽
【正文】 ransport to brain with targeted nanoparticles [J]. NeuroRx174。然而，其體內(nèi)毒性和長期毒性還有待進(jìn)一步考察。此外，PEG的毒性也很低[28]。的研究表明被K562髓性白血病細(xì)胞攝取后的Lf可以進(jìn)入細(xì)胞核并與DNA結(jié)合，Nuijens等人的研究也表明Lf可能具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能，這與我們觀察到LfNP在細(xì)胞核中的分布相一致。因此。本文采用Lf構(gòu)建的新型生物可降解腦內(nèi)遞藥系統(tǒng)LfNP粒徑在150nm以下，適宜用于腦內(nèi)遞藥。 B periventricular region of the third ventricle after LfNP administration。給予LfNP和NP后，血中的香豆素6濃度沒有顯著差異，說明少量Lf連接在納米粒表面并不影響PEG的長循環(huán)功能。這說明LfNP通過不同于NP的機(jī)理轉(zhuǎn)運(yùn)入腦。C. The magnification bar is 100 181。C incubation for 30 min 圖3 37 186。C incubation for 1h, respectively。C孵育1h后的攝取情況；B10 μg/ml Lf–NP和NP在37 186。2h后，LfNP廣泛分布在整個(gè)細(xì)胞且進(jìn)入細(xì)胞核（圖3H）而NP則主要分布于胞漿。LfNP的攝取量高于NP，提示由于Lf的引入LfNP可能存在不同于NP的內(nèi)吞機(jī)理。37 186。 E NP stained with antiLf primary antibody and 10nm colloidal gold labeled rabbit antigoat IgG sequentially. LfNP腦內(nèi)遞藥特性和生物相容性的體外評(píng)價(jià)，各時(shí)間點(diǎn)LfNP的攝取量均高于NP。圖1納米粒的透射電子顯微鏡照片，標(biāo)尺均為100 nmANP；BLfNP；C加入抗Lf一抗和連接有10nm膠體金兔抗羊IgG二抗后的LfNP；D僅加入連接有10nm膠體金兔抗羊IgG二抗的LfNP；E加入抗Lf一抗和連接有10nm膠體金兔抗羊IgG二抗后的NPFig. 1 Transmission electron micrograph of different nanoparticles negatively stained with phosphotungstic acid solution. Bar on each photo was 100 nm.A NP。%；透射電鏡下可以清楚的觀察到，LfNP表面標(biāo)記有黑色的膠體金顆粒（圖1C），而未加入山羊抗Lf抗體孵育的LfNP（圖1D）和NP表面（圖1E）未見膠體金顆粒，證實(shí)該納米粒表面連接有Lf。以SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)采集3只小鼠樣品。用酶標(biāo)儀在450 nm處讀數(shù)。用 1% TritonX 100 400 μl溶解細(xì)胞。將載有香豆素6的LfNP和NP稀釋成含1－60 μg/ml的納米粒供試液，按不同濃度每孔加入1 ml（空白孔加1 ml HBSS），分別放入37℃及4℃孵育1 h，考察細(xì)胞在4℃和37℃下對(duì)LfNP和NP的攝取情況。 LfNP腦內(nèi)遞藥特性和生物相容性的體外評(píng)價(jià) ，置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)1天。采用透射電鏡技術(shù)（TEM）和動(dòng)態(tài)光散射分析（DLS）對(duì)LfNP和NP的形態(tài)，粒徑進(jìn)行表征。2. 實(shí)驗(yàn)方法 NP和LfNP的制備及表征馬來酰亞胺基聚乙二醇聚乳酸和甲氧基聚乙二醇聚乳酸1：9混合以復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備NP [19]。此外，聚乙二醇和聚乳酸都是FDA已批準(zhǔn)的輔料，將使載藥系統(tǒng)具有較好的生物相容性和安全性[17，18]?，F(xiàn)已證明多種生物BBB表面均存在Lf受體（LfR），能夠介導(dǎo)Lf轉(zhuǎn)運(yùn)[1214]。然而，脂質(zhì)體的穩(wěn)定性差及單克隆抗體效果的不穩(wěn)定限制了其進(jìn)一步應(yīng)用[810]。局部侵入給藥（腦內(nèi)直接注射/滴注）易引發(fā)感染，手術(shù)費(fèi)用高且有效遞藥面積有限[3]。 Biodegradable nanoparticle。結(jié)論 LfNP能顯著增加藥物的腦內(nèi)遞送且具有較好的生物相容性，有望作為一種新型的腦內(nèi)遞送系統(tǒng)輸送蛋白多肽和基因等大分子藥物入腦。免疫電鏡技術(shù)，X射線光電子能譜分析及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)證實(shí)了LfNP表面共價(jià)連接有Lf，且每個(gè)LfNP表面的Lf數(shù)約為55。采用透射電鏡技術(shù)，免疫電鏡技術(shù)，動(dòng)態(tài)光散射分析，X射線光電子能譜分析及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)LfNP的形態(tài),粒徑和表面Lf的連接進(jìn)行鑒定和表征。 方法 采用馬來酰亞胺基聚乙二醇聚乳酸和甲氧基聚乙二醇聚乳酸通過復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備納米粒（NP）,將其與巰基化的乳鐵蛋白（Lf）共價(jià)連接制得LfNP。 結(jié)果 制得的LfNP形態(tài)圓整，粒徑在110 nm左右。3 mg/。 Coumarin6。隨著現(xiàn)今腦部疾病發(fā)病率的不斷升高，通過各種給藥系統(tǒng)和靶向策略增加藥物的腦內(nèi)傳遞已成為解決這一問題的關(guān)鍵。目前最具代表性的受體介導(dǎo)腦內(nèi)遞藥系統(tǒng)OX–26結(jié)合的免疫脂質(zhì)體成功用于小分子藥物及基因藥物的腦內(nèi)遞送，證實(shí)了受體介導(dǎo)途徑優(yōu)良的腦內(nèi)遞藥能力[6, 7]。Lf具有抗炎，免疫調(diào)節(jié)，抗菌及抗癌等多種生理功能[11]。采用聚乙二醇聚乳酸納米粒與Lf連接是基于納米粒相對(duì)于脂質(zhì)體的諸多優(yōu)點(diǎn)：具有較好的穩(wěn)定性，處方中輔料種類較少，制備相對(duì)簡單，具有一定的緩釋能力便于慢性疾病的治療[16]。乳鐵蛋白（Sigma, 美國）；MPEG（Mr 3000，SUNBRIGHTTM MEH30H，NOF，日本）；MaleimidePEG（Mr 3400，NEKTAR，美國）；Traut’s試劑（Sigma，美國）；山羊抗Lf抗體（Bethyl，美國）；10 nm 膠體金標(biāo)記兔抗山羊IgG抗體（Sigma，美國）；Lf ELISA試劑盒（Bethyl，美國）；HiTrap脫鹽柱（Amersham Pharmacia Biotech AB，瑞典）；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清（Gibco，美國）；熒光封片劑（Dako，美國）；香豆素6（Aldrich，德國）；CCK8（Dojindo Laboratories，日本）； BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海申能博彩公司，中國）；昆明鼠（1820 g，♂，復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部）。成初乳前有機(jī)相中加入香豆素6，制備載香豆素6的 NP和LfNP，以Sepharose CL4B除去未包封的香豆素6。考察載香豆素6的LfNP和NP在pH pH 。試驗(yàn)結(jié)束后，棄去納米粒溶液，細(xì)胞用1 ml冰冷的PBS終止攝取，再用PBS 1ml沖洗5次。分別加入樣品濃度為0－ mg/ml 的Lf、NP和LfNP的PBS溶液，37℃孵育4 h，溶液用110 μl 新鮮的培養(yǎng)液（含CCK8 10 μl）替換，37℃孵育4 h。54只小鼠平均分成2組，每組分別尾靜脈注射載香豆素6的LfNP和NP溶液（%和0. 71%） 60 mg/kg，1，2，4，8，12和24 h摘眼球取血后處死，迅速取出大腦去除腦膜上的血管，稱重后20℃保存。由各時(shí)間點(diǎn)三個(gè)樣本的平均藥物濃度經(jīng)劑量校正后對(duì)相應(yīng)的時(shí)間作圖，得藥時(shí)曲線，梯形法計(jì)算藥時(shí)曲線下面積（AUC0t）。 ）nm。體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明載香豆素6的LfNP和NP在pH pH %，因此，香豆
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