代謝型谷氨酸受體4亞型高通量藥物篩選模型的建doc-在線瀏覽
2024-08-25 22:29本頁面
【正文】 phate (MSOP)(RS)aMethyl4phosphonophenylglycine (MPPG). Z’ factor value of the cell line in 96 and 384well plate format was and . Our data indicate a successful development of functional human mGluR4 rebinant stable cell line that was suitable for high throughput screening to identify mGluR4 agonist/antagonist.Keywords: metabotropic glutamate receptor 4 (mGluR4), high throughput screening (HTS), Ga15, agonist/antagonist463 / 7谷氨酸是公認(rèn)的最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一, 其在眾多的中樞神經(jīng)功能方面發(fā)揮著重要的作用, 例如: 記憶的獲取與學(xué)習(xí), 癲癇、中風(fēng)等功能紊亂, 神經(jīng)退行性疾病等[1]。谷氨酸受體分為2類: 離子型谷氨酸受體(Ionotropic receptors)和代謝型谷氨酸受體(Metabotropic receptors)。methyl4. isoxazole propionate, AMPA), 該類受體被激活后能促使離子通道開放, 從而陽離子如Na+、Ca2+等進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。根據(jù)代謝型谷氨酸受體氨基酸系列同源性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和藥理學(xué)特性, 將其分為3組: 第1組包括mGluR1和mGluR5, 能被3,5DHPG選擇性的激活, 它們被激活后, 使PLC活化, 促使PI水解產(chǎn)生IP3和DAG, 增強(qiáng)iGluRs異常介導(dǎo)的神經(jīng)興奮毒性。 第3組由mGluRmGluRmGluR7和mGluR8組成, 其同樣是負(fù)調(diào)控AC, 可以被LAP4激活[4,5]。神經(jīng)遞質(zhì)傳遞的異常將會(huì)引起眾多的疾病。代謝型谷氨酸受體4亞型(mGluR4)集中分布于小腦顆粒細(xì)胞中, 在嗅覺組織中也發(fā)現(xiàn)mGluR4特異性的表達(dá)[5]。大規(guī)模的藥物開發(fā)必不可少的要應(yīng)用高通量篩選(High throughput screening, HTS)平臺(tái), 這樣不僅可以節(jié)省人力、物力, 又可以大大縮短藥物研發(fā)前期所消耗的時(shí)間。 Kowal D等用人mGluR4基因和Gqi穩(wěn)定共轉(zhuǎn)染倉鼠卵巢細(xì)胞(CHOK1)并用于mGluR4的相關(guān)研究[7]。結(jié)果表明, 一個(gè)基于重組細(xì)胞水平的功能性檢測(cè)、適用于鑒定mGluR4激動(dòng)劑/拮抗劑的HTS平臺(tái)被成功建立。 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium powder, high glucose, Gibco BRL)。 FBS (Fetal Bovine Serum, Hyclone)。 選擇性抗生素Zeocin (Invitrogen)。 MatriGel174。 轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 (Invitrogen)。 Probenecid (Sigma)。 LAP4 (L(+)2Amino4phosphonobutyric acid), LSOP (LSerineOphosphate), MPPG ((RS) a Methyl4phosphonophenylglycine)和MSOP ((RS)a MethylserineOphosphate)從Tocris購買。所得到的表達(dá)質(zhì)粒命名為mGluR4 pcDNA4/To. 穩(wěn)定表達(dá)mGluR4細(xì)胞系構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Ga15蛋白的人胚腎細(xì)胞(HEK293/ Ga15)培養(yǎng)在含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中, 置于37oC, 5% CO2溫箱中培養(yǎng)。使用LipofectamineTM2000將人源mGluR4pcDNA4/TO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293/Ga15細(xì)胞(轉(zhuǎn)染操作參照試劑盒說明書進(jìn)行), HEK293/Ga15細(xì)胞作為陰性對(duì)照。細(xì)胞貼壁生長24 h之后, 加入120 mg/mL Zeocin進(jìn)行抗生素篩選。當(dāng)陰性對(duì)照細(xì)胞(沒有轉(zhuǎn)染的HEK293/Ga15)在抗生素作用下完全死亡之后, 挑選單細(xì)胞克隆團(tuán)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(Corning costar)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。選擇具有明顯鈣流信號(hào)變化的細(xì)胞克隆(設(shè)定為P0代)傳代培養(yǎng), 并進(jìn)行進(jìn)一步的功能驗(yàn)證。 鈣流檢測(cè)試驗(yàn)方法鈣流檢測(cè)方法是通過使用儀器FlexStation (Molecular devices)檢測(cè)熒光染料Fluo3/AM標(biāo)記的鈣流變化, 在FlexStation熒光成像分析系統(tǒng)中, 激發(fā)波長為485 nm, 發(fā)射波長為525 nm。 Matrix預(yù)先包被的96孔黑壁透明底板中(Cloning costar), 過夜培養(yǎng)于37oC、5% CO2溫箱。進(jìn)行鈣流檢測(cè)試驗(yàn)時(shí), 小心吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基, 每孔細(xì)胞中加入100 mL含有1 mmol/L Probenecid, 1Quencher和4 mmol/L Fluo3/AM的1HBSS buffer ( mmol/L CaCl2, mmol/L MgCl2, mmol/L MgSO4, mmol/L KCl, mmol/L KH2PO4, mmol/L NaCl, mmol/L Na2HPO4, mmol/L DGlucose, 20 mmol/L HEPES, mmol/L NaHCO3, pH ), 將細(xì)胞置于37oC避光孵育90 min。檢測(cè)拮抗劑活性時(shí), 將激動(dòng)劑LGlu和拮抗劑分別配制成10測(cè)試濃度, 并將其等體積混合成5測(cè)試濃度, 以25 mL/s的速度將25 mL的化合物加入到細(xì)胞中, 在加入化合物16 s之后采集鈣流數(shù)據(jù)直至120 s以上。本實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)都是經(jīng)過2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)所獲得的平均值, 并且檢測(cè)平均標(biāo)準(zhǔn)偏差(177。Z’ 因子用下面公式計(jì)算:Z’ =13(|SD signal| + |SD background|)/(|Mean signal| |Mean background|)2 結(jié)果 陽性克隆篩選將人mGluR4重組質(zhì)粒(mGluR4pcDNA4/TO)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)Ga15的HEK293細(xì)胞株, 通過抗生素的篩選共得到68個(gè)重組細(xì)胞株。其中, 檢測(cè)到32個(gè)克隆有明顯的鈣信號(hào), 但母細(xì)胞系HEK293/Ga15胞內(nèi)鈣離子水平?jīng)]有變化。 篩選條件的優(yōu)化某檢測(cè)方法是否適用于HTS, 具有嚴(yán)格的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn), 例如: 好的信躁比值, 高靈敏度以及一致 性[11]。鈣熒光染料(Fluo3/AM)的孵育時(shí)間是影響鈣流檢測(cè)系統(tǒng)信躁比值的因素之一。鈣熒光染料孵育時(shí)間越長, 就能得到越高的鈣流信號(hào)(數(shù)據(jù)沒有顯示)。為了評(píng)估由通用溶劑DMSO和NaOH引起的非特異性本底, DMSO 和NaOH耐受性通過鈣流檢測(cè)試驗(yàn)被測(cè)定。因此, 在后續(xù)試驗(yàn)中, %%。首先, 通過胞內(nèi)鈣流檢測(cè)試驗(yàn), 得到3種激動(dòng)劑(LGlu、LAP4和 LS
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