代謝型谷氨酸受體4亞型高通量藥物篩選模型的建doc-文庫吧資料
2024-07-28 22:29本頁面
【正文】 screening assay quality assessment. J Biomol Screen, 2007, 12(2): 229234.。本研究所建立的mGluR4的重組細(xì)胞系是一個(gè)靈活的、穩(wěn)定的、有效的、適用于HTS體系, 可以用于藥理學(xué)分析、功能性研究以及篩選mGluR4的激動(dòng)劑/拮抗劑。綜上所述, 本研究第一次用HEK293/Ga15母細(xì)胞建立了一個(gè)穩(wěn)定高表達(dá)人源mGluR4的重組細(xì)胞系: mGluR4/HEK293/Ga15。在96及384孔板上所得到的Z’, 這強(qiáng)有力地證明mGluR4細(xì)胞系適用于HTS。結(jié)果顯示, 這個(gè)重組細(xì)胞系適用于發(fā)現(xiàn)mGluR4的激動(dòng)劑/拮抗劑。首先, 使用激動(dòng)劑LGlu對(duì)mGluR4/HEK293/Ga15鈣流檢測(cè)試驗(yàn)時(shí)的一些系統(tǒng)檢測(cè)因子, 包括鈣熒光染料的孵育時(shí)間, DMSO耐受性和NaOH耐受性進(jìn)行了優(yōu)化。由圖2可以看出, 在激動(dòng)劑LAP4的作用下, mGluR4/HEK293/Ga15細(xì)胞產(chǎn)生了內(nèi)部鈣流變化, 并且呈劑量依賴關(guān)系, mmol/L, 而母細(xì)胞HEK293/Ga15卻沒有類似明顯的胞內(nèi)鈣流的變化。更重要的是, Gi類的G蛋白不能引起細(xì)胞內(nèi)的鈣流變化。在本研究中, 選擇HEK293/Ga15作為表達(dá)人源mGluR4的母細(xì)胞。 Negative: assay buffer with % DMSO.3 討論mGluR4是結(jié)合于Gi類的G蛋白, 目前對(duì)Gi偶聯(lián)的G蛋白偶聯(lián)受體可以通過同位素結(jié)合試驗(yàn), cAMP定量試驗(yàn)、報(bào)告基因系統(tǒng)、熒光檢測(cè)鈣流等方法進(jìn)行檢測(cè)?？傊? 該模擬篩選結(jié)果顯示, mGluR4檢測(cè)方法適用于HTS以鑒定mGluR4的活性化合物。模擬篩選結(jié)果顯示, 在該96孔板不同位置所設(shè)置的陽性對(duì)照(300、100、30和10 mmol/L LGlu)及陰性對(duì)照(緩沖液)都檢測(cè)到了相應(yīng)的鈣信號(hào)(圖6)。用上述建立好的mGluR4鈣流檢測(cè)方法篩選74種已知化合物(包括小分子化合物及具有活性的多肽)。 模擬篩選進(jìn)行HTS時(shí), 成千上萬的化合物都會(huì)用數(shù)塊96或384孔板進(jìn)行HTS篩選。 SEM. EC50 and IC50 value were determined using GraphPad Prism 5 software.圖5 Z’因子檢測(cè)Fig. 5 Z’ factor determination. mGluR4/HEK293/Ga15 cell line was stimulated with 100 mmol/L LGlu (positive) and assay buffer (negative). Assays were monitored with FlexStation plate reader. (A) 96well plate format. (B) 384well plate format.不僅檢測(cè)了用96孔板進(jìn)行鈣流檢測(cè)試驗(yàn)時(shí)的Z’因子(圖5A), 同時(shí)也用384孔板進(jìn)行了檢測(cè)(圖5B)。 當(dāng)Z’＜0時(shí), 意味著此檢測(cè)系統(tǒng)根本不可行[20]。 當(dāng)0＜Z’＜, 意味著此檢測(cè)系統(tǒng)基本可行。Z’因子的大小介于 –∞ 和1之間。 SEM. IC50 value was determined using GraphPad Prism 5 software.表2 mGluR4激動(dòng)劑LGlu和拮抗劑MSOP作用于不同代細(xì)胞之間的活性總結(jié)(單位: mmol/L)Table 2 Potency of LGlu and MSOP at different passages of cells (mmol/L)PotencyP1P5P10P20LGluEC50MSOPIC50 Z’因子評(píng)估高質(zhì)量的檢測(cè)系統(tǒng)以及強(qiáng)有力的數(shù)據(jù)分析為鑒定真正有活性的化合物提供了保證。由此可見, 該mGluR4/HEK293/ Ga15細(xì)胞株是穩(wěn)定的。之后同時(shí)檢測(cè)LGlu或MSOP在這幾代的mGluR4細(xì)胞上的作用。一旦靶體選定, 穩(wěn)定表達(dá)該靶體的細(xì)胞系就要被構(gòu)建并且在傳代培養(yǎng)時(shí)不被丟失。MSOP和MPPG的半數(shù)有效抑制濃度(IC50)分別是 mmol/ mmol/L (圖3)。 SEM. EC50 value was determined using GraphPad Prism 5 software.另外, 通過鈣流檢測(cè)方法, 本研究測(cè)試了2個(gè)拮抗劑MSOP和 MPPG。 LSOP和LGlu次之, mmol/ mmol/L(圖2)。結(jié)果表明, 這3個(gè)激動(dòng)劑的半數(shù)有效刺激濃度(EC50)均與文獻(xiàn)報(bào)道相符(表1)。圖1 DMSO (A)和NaOH (B)耐受性檢測(cè)Fig. 1 DMSO (A) and NaOH (B) tolerance detection. Assays were performed in duplicate and monitored with FlexStation plate reader. mGluR4/HEK293/Ga15細(xì)胞株功能性檢測(cè)在以上優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下, 分別用不同濃度的mGluR4激動(dòng)劑 (LGlu、LAP4和 LSOP) 和拮抗劑(MSOP和 MPPG) 作用于mGluR4/HEK293/ Ga15細(xì)胞株, 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化, 以證實(shí)mGluR4篩選模型的功能活性。試驗(yàn)結(jié)果表明, % (圖1A)% (圖1B)時(shí), 對(duì)于在mGluR4/HEK293/Ga15細(xì)胞株上進(jìn)行鈣流檢測(cè)試驗(yàn)沒有顯著的影響。在以下的試驗(yàn)當(dāng)中, 鈣熒光染料的時(shí)間被選定為90 min。為了在mGluR4/ HEK293/Ga15細(xì)胞株得到高的信躁比, 本研究首先優(yōu)化了鈣熒光染料的孵育時(shí)間。為了評(píng)估在檢測(cè)系統(tǒng)中產(chǎn)生的信號(hào)的動(dòng)力學(xué)效應(yīng), 諸如熒光染料的孵育時(shí)間, 溶劑DMSO和NaOH的耐受性等鈣流檢測(cè)參數(shù)都被做了優(yōu)化。最終挑選了1個(gè)信號(hào)較強(qiáng)的克隆作為待定細(xì)胞株, 命名為mGluR4/HEK293/Ga15, 進(jìn)行擴(kuò)大及傳代培養(yǎng), 進(jìn)一步考察其特異性及穩(wěn)定性, 同時(shí)優(yōu)化其用于HTS時(shí)的篩選條件。用500 mmol/L L Glu激活mGluR4, 從而引發(fā)內(nèi)鈣動(dòng)員, 進(jìn)而檢測(cè)鈣信號(hào)。 SEM)。 數(shù)據(jù)分析化合物劑量依賴關(guān)系使用軟件GraphPad Prism 5進(jìn)行非線性曲線擬合分析。激動(dòng)劑(LGlu, LAP4或LSOP)配制成5測(cè)試濃度, 以25 mL/s的速度將25 mL的化合物加入到細(xì)胞中, 在加入化合物16 s之后采集鈣流數(shù)據(jù)直至120 s以上。第2天, 小心吸棄孔中全部培養(yǎng)基, 每孔細(xì)胞加入100 mL含有5% dFBS的glutaminefree DMEM, 在37oC、5% CO2溫箱培養(yǎng)12~24 h。細(xì)胞以2 104 /well的密度接種于MatriGel174。當(dāng)細(xì)胞生長到90%匯合率的時(shí)候即進(jìn)行傳代培養(yǎng), 以1:8到1:10的比例傳代培養(yǎng)于含有5 mL新鮮培養(yǎng)基(加有60 mg/mL Zeoci
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