實驗課-制藥工程生化原理與制備實驗指doc-在線瀏覽
2024-08-25 04:38本頁面
【正文】 位，SDS可使蛋白質(zhì)亞單位中的氫鍵、疏水鍵打開，因此SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，蛋白質(zhì)—SDS復合物形狀近似雪茄形的長橢圓棒，不同復合物的短軸相同，而長軸改變則與蛋白質(zhì)的分子量成正比。在電泳體系中加入十二烷基硫酸鈉（簡稱SDS），則電泳遷移率主要依賴于蛋白質(zhì)分子量，而與所帶的凈電荷和形狀無關(guān)，這種電泳方法稱為SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS—PAGE）。根據(jù)上述方程將已知分子量的標準蛋白質(zhì)電泳遷移率與分子量的對數(shù)作圖，可制作出一條標準曲線。不同的凝膠濃度適用于不同的分子量范圍（見下表1），可根據(jù)所測分子量的范圍選擇最適凝聚濃度，并盡可能選擇分子量范圍和性質(zhì)與待測樣品相近的蛋白質(zhì)作標準蛋白。SDS—PAGE作為一種測定蛋白質(zhì)分子量的方法，盡管對于大部分蛋白質(zhì)來說，在比較廣泛的分子量范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的遷移率與其分子量的對數(shù)確實存在著線性關(guān)系，但是有許多蛋白質(zhì)是由亞基或兩條以上肽鏈組成的（如血紅蛋白、胰凝乳蛋白酶等），他們在變性劑和強還原劑的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。為此，對這類樣品分子量的測定，還必須采用其他測定方法作參照。另外，還有一些電荷異常和構(gòu)象特殊的蛋白質(zhì)（如組蛋白F1），含有較大輔基的糖蛋白和含有二硫鍵較多的蛋白質(zhì)，以及一些結(jié)構(gòu)蛋白（如膠原蛋白）等，它們在SDS—凝膠系統(tǒng)中，電泳的遷移率與分子量的對數(shù)不呈線性關(guān)系。三、器材（附帶凝膠模135100，1臺/組），（電壓300—600V，電流50—100mA），3細長頭的滴管1只/組，（10或50μL），四、試劑1. 蛋白Marker20次/支：按使用說明配制2. BSA（牛血清白蛋白）3. 連續(xù)體系SDS—PAGE有關(guān)試劑1）：稱 Na2HPO4溶于重蒸水中并定容1L。Tris?Cl (pH )10% (W/V)溴酚藍（BPB）50% (V/V)β巰基乙醇（2ME）配制量 5 ml配制方法： a．稱量下列試劑置于10ml 塑料離心管中。 ml SDS （電泳級）25 mg 甘油 c．小份（500 ul/份）分裝后于室溫保存。 e．加入2ME的樣品溶解液可在室溫下保存一個月左右。4) 凝膠緩沖液 。5) 1%TEMED取TEMED1ml，加重蒸水至100ml，置棕色瓶內(nèi)4℃貯存。7) 電極緩沖液（%SDS，）：稱SDS1克，再用蒸餾水定容至1L。4. 固定液取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混勻。6. 脫色液冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸餾水定容至1L。這種電泳槽兩側(cè)為有機玻璃制成的電極槽，兩個電極槽中間夾有一個凝膠模，該模由1個凵形硅膠框、長與短玻璃板及樣品槽模板（梳子）所組成。兩個電極槽與凝膠模間靠貯液槽螺絲固定。2） 將長、短玻璃板分別插到凵形硅膠框的凹形槽中。3） 將已插好玻璃板的凝膠模平放在上貯槽上，短玻璃板應(yīng)面對上貯槽。5） 豎直電泳槽，用細長頭滴管吸取已熔化的2%瓊脂（糖）加在長玻璃板下端與硅膠框交界的縫隙內(nèi)，其目的是封住空隙，加瓊脂（糖）溶液時中應(yīng)避免有氣泡。下表表示配制10ml不同濃度分離膠所需各種試劑用量（單位/ml）。再向兩塊玻璃板中間加入濃縮膠，插入梳子。倒入電極緩沖液即可準備加樣。如果樣品槽中有氣泡，可用注射器針頭挑除。（四）電泳上槽接負極，下槽接正極，打開電源，將電流調(diào)至20mA，待樣品進入分離膠后，將電流調(diào)至60mA，待染料前沿遷移至距硅膠框底邊1—，停止電泳。在兩側(cè)溴酚藍染料區(qū)帶中心，插入細銅絲作為前沿標記。（七）繪制標準曲線將大培養(yǎng)皿放在一張坐標紙上，量出加樣端距細銅絲間的距離（cm）（即染料遷移距離）以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離（cm）（即樣品遷移距離），如圖所示。 樣品及標準蛋白在連續(xù)SDSPAGE分離示意圖樣品槽1,2,4,5,為待測樣品，樣品槽3為標準蛋白六 注意事項1. SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合按質(zhì)量成比例（即：），蛋白質(zhì)含量不可以超標，否則SDS結(jié)合量不足。因此，對于這一類蛋白質(zhì)，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對分子量。思考題1. SDS—PAGE用于蛋白質(zhì)分子量測定的基礎(chǔ)是什么？2 SDSPAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）與PAGE有何不同？實驗三 質(zhì)粒DNA的提取及電泳一、目的l 了解堿裂解質(zhì)粒提取過程中各種純化步驟的設(shè)計思想。l 掌握水平式瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA的方法、步驟。二 實驗原理 裂解法是小量提取質(zhì)粒最常用的方法，是根據(jù)共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離質(zhì)粒DNA。共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確，而線性的染色體DNA兩條互補鏈彼此已完全分開，復性就不會那么迅速而準確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)S
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