【正文】 甜菜 ~ 燕麥粉 ~ 甘蔗糖蜜 ~ 大豆粉 玉米漿 乳清粉 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 （ 3）無機(jī)鹽 及微量元素 ? 大量元素： P、 S、 K、 Mg、 Ca、 Na、 Fe等。 ? （微生物生長所需濃度在 106~108mol/L） ? 一般微生物生長所需要的無機(jī)鹽有：硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物以及含有鈉、鉀、鎂、鐵等金屬元素的化合物。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 （ 4）生長因子 ? 從廣義上講，凡是微生物生長不可缺少的微量的有機(jī)物質(zhì)，如 氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素 等均稱 生長因子 。 ? 生長因子不是所有微生物都必需的，對于營養(yǎng)缺陷 ? 型才是必不可少的。 ? （ 1）調(diào)節(jié)好基礎(chǔ)料的 pH。若要控制消后 pH在 ，消前 pH往往要調(diào)到 ~。 ? 如代謝產(chǎn)酸物質(zhì)：葡萄糖（產(chǎn)酮酸）、（ NH4)2SO4 ? 代謝產(chǎn)堿物質(zhì)： NaNO尿素 ? 緩沖劑： CaCO磷酸緩沖液等 ? 生理酸、堿性物質(zhì)： ? (NH4)2SO4 → 2NH3 + 2H2SO4 ? NaNO3 + 4H2 → NH3 + 2H2O + NaOH 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 二、酶生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù) ? （ 3）、通過補(bǔ)料調(diào)節(jié) pH ? 在發(fā)酵過程中根據(jù)糖、氮消耗需要進(jìn)行補(bǔ)料。 阿累尼烏斯方程式 ( 1 )........RTEAek ??k反應(yīng)速度常數(shù)， 1/s ； A阿累尼烏斯常數(shù)， 1/s 。 T熱力學(xué)溫度， K （ 0℃ =273K) 。 則：隨著溫度升高酶反應(yīng)速度增加 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 溫度對 合成的方向 的影響 例：四環(huán)素發(fā)酵中金色鏈霉菌同時能產(chǎn)生金 霉素。 ? 溫度提高 ——合成四環(huán)素的比例也提高。 又如：赭曲霉 10 ℃ ——20 ℃ 發(fā)酵時，有利于合成青霉素 28 ℃ 時，則有利于合成赭曲霉素。因 為在稍低溫度下氨基酸合成蛋白質(zhì)和核酸的正常途徑關(guān) 閉得比較嚴(yán)密有利于產(chǎn)物合成。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 發(fā)酵熱和溫度的控制 ?發(fā)酵熱 ? Q發(fā)酵 =Q生物 + Q攪拌 – Q蒸發(fā) – Q輻射 ? 產(chǎn)熱因素：生物熱、攪拌熱 ? 散熱因素：蒸發(fā)熱、輻射熱 ?溫度的控制 通過冷卻將顯熱進(jìn)行熱交換，以保持最佳發(fā)酵溫度 發(fā)酵罐的冷卻裝置： 夾套（ 10M3以下 ） 盤管（蛇管） 列管 噴淋 冷媒： 冷水 冷鹽水 氨 建立冷凍站 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 二、酶生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù) ? ? ——溶解氧的調(diào)節(jié)控制 p12,p16 ? 微生物的需氧 ? 氧在水中的溶解度比葡萄糖要小約 6000倍左右 (氧在水中的飽和度約為 ) 。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 描述微生物需氧的物理量 p12 ? KO2——好氧速率（攝氧率），單位時間內(nèi)單位 體積的發(fā)酵液所需要的氧量； mmol O2/（ L ? QO2 ——細(xì)胞呼吸強(qiáng)度，單位重量細(xì)胞在單位時間耗氧量；mmol O2 /（ g細(xì)胞 ? C0 ——細(xì)胞濃度，單位體積培養(yǎng)液中細(xì)胞的量； g細(xì)胞 /L KO2 = QO2 . C0 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 臨界 溶氧濃度 ? Cr: 臨界溶氧濃度 , 指不影響呼吸所允許的最低溶氧濃度。S）， ? 發(fā)酵液中有 mmol /L ? ? 由于產(chǎn)物的形成和菌體最適的生長條件，常常不一樣 ： ? 頭孢菌素 卷須霉素 ? 生長 5% (相對于飽和濃度） 13% ? 產(chǎn)物 13% 8% 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 溶氧對發(fā)酵的影響 例：天冬酰胺酶的發(fā)酵 ? 前期好氣培養(yǎng)，后期轉(zhuǎn)為厭氣培養(yǎng)。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 溶氧曲線 谷氨酸 ? 每種產(chǎn)物發(fā)酵的溶氧濃度變化都有自己的規(guī)律 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 發(fā)酵過程中溶氧變化異常原因 ? （ 1）污染好氣性雜菌，大量溶氧被消耗，反之下降。 ? （ 3）攪拌功率變小，攪拌速度變慢或停止。 ? 污染烈性噬菌體：影響最為明顯，生產(chǎn)菌尚未裂解前，呼吸已受到抑制，溶氧上升，直到菌體破裂后，完全失去呼吸能力，溶氧直線上升。h ） 。 ? 或 kd ? 經(jīng)驗(yàn)公式： 39。)(39。39。39。39。在低通氣量的情況下，增大通氣量對提高溶氧濃度有十分顯著的效果。比如：泡沫的形成、水分的蒸發(fā)、罐溫的增加以及雜菌幾率增加等。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 (3) 改變氣體組成中的氧分壓 ? 用通入純氧方法來改變空氣中氧的含量，提高了 C*值，因而提高了供氧能力。但有可能造成細(xì)胞氧中毒。 主要原因是： ? ① 提高罐壓就要相應(yīng)的增加空氣壓縮機(jī)的出口壓 力 ， 也就是增加了動力消耗 。 供氧的控制 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 (5) 改變發(fā)酵液的理化性質(zhì) ? 在發(fā)酵過程中 ,菌體本身的繁殖及代謝可引起發(fā)酵液性質(zhì)不斷改變 , 因而顯著地影響到氧的溶解速率 ， 而且由于發(fā)酵液中 菌絲濃度所引起的表觀粘度的增加 ， 可使通氣速率下降 。 供氧的控制 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 （ 6） 加入傳氧中間介質(zhì) ——氧載體 ? 向發(fā)酵液中加入少量的水不溶性另一相 ， 氧在這一液相中具有比水中高得多的溶解度 . ? 如常用的 正十二烷 ， 這類物質(zhì)又稱 氧載體：作為非連續(xù)相 ，在攪拌的氣液體系中被分散成比氣泡小得多的微滴 ， 附著在氣泡表面并在氣泡－水界面之間形成一層薄膜 ， 使氧氣通過水膜溶入水相主流的推動力 （ 氧濃度差 ） 增大 ， 相應(yīng)提高了傳氧速率 。LJacob）發(fā)表 “ 蛋白質(zhì)合成中的遺傳調(diào)節(jié)機(jī)制 ” 一文，提出操縱子學(xué)說，開創(chuàng)了基因調(diào)控的研究。 ? 1969年，貝克維斯（ JBeckwith）從大腸桿菌的 DNA中分離出乳糖操縱子，完全證實(shí)了雅可布和莫諾的模型。 ? 另一種組成突變體為變異的 操縱基因， 它不易因阻遏蛋白的作用而失活，從而導(dǎo)致操縱基因開放而連續(xù)產(chǎn)生酶。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 結(jié)構(gòu)類似物 ? 乳糖的結(jié)構(gòu)類似物 ? 1,6半乳糖 ? 異丙基 βD硫代半乳糖苷（ IPTG） ? 甲基 βD半乳糖等 ? 如： 葡萄糖異構(gòu)酶（或稱木糖異構(gòu)酶），若在培養(yǎng)基中加入 %木糖 能誘導(dǎo)合成該酶。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 （ 1）酶的合成調(diào)節(jié)機(jī)制 ? 2）酶合成的反饋?zhàn)瓒? 是指酶作用的終產(chǎn)物對酶合成產(chǎn)生阻遏作用。 立體阻遏物 RNA聚合酶 共阻遏物 R P O DNA S DNA 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 反饋?zhàn)瓒魴C(jī)制實(shí)踐意義 ? ① 設(shè)法從培養(yǎng)基中除去終產(chǎn)物，以消除反饋?zhàn)瓒簟? ? 此外，限制培養(yǎng)基中 氨 的含量或限制末端產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的積累，也可增加酶的產(chǎn)量。 ? 例：組氨酸對組氨酸合成途徑中的 10種酶的生物合成均起反饋?zhàn)饔谩? 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 （ 1）酶的合成調(diào)節(jié)機(jī)制 3）分解代謝對酶合成的阻遏作用（中間產(chǎn)物阻遏） ? 指被菌體迅速利用的底物或其分解產(chǎn)物對許多酶（降解酶、合成酶）合成的抑制作用。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 葡萄糖效應(yīng) ? 葡萄糖和乳糖同時存在，細(xì)菌便會自動優(yōu)先利用葡萄糖。RNA聚合酶 環(huán)腺苷酸結(jié)合不到位點(diǎn)上，使無法轉(zhuǎn)錄。只有當(dāng)這兩個開關(guān)都處于開啟狀態(tài)時，結(jié)構(gòu)基因才能活化。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 銨阻遏 ? 氮分解產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用指的是被菌體迅速利用的氮源（特別是銨）能阻抑某些參與含氮化合物代謝的酶的合成。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 （ 1）酶的合成調(diào)節(jié)機(jī)制 ? 誘導(dǎo)型操縱子； ? 阻遏型操縱子； ? 阻遏型操縱子形式 ? 末端產(chǎn)物或終產(chǎn)物阻遏； ? 分解代謝產(chǎn)物阻遏（中間產(chǎn)物）； 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 （ 1）酶的合成調(diào)節(jié)機(jī)制 ? 4）酶合成的細(xì)胞膜通透性調(diào)節(jié) ? 微生物的細(xì)胞膜對于細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的運(yùn)輸具有高度選擇性。 ? ? 機(jī)制： 生物素 是合成脂肪酸的關(guān)鍵酶 乙酰 CoA 羧化酶