【正文】 胞破碎。 ? （ 1）高壓沖擊法是在結(jié)實(shí)的容器中裝入菌體細(xì)胞和冰晶、石英砂等混合物，用活塞或沖擊錘加高壓沖擊之，使細(xì)胞破碎。 MantonGaulin homogeniser valve 壓力差破碎法 ? （ 2）突然降壓法是將菌體裝進(jìn)高壓容器中，加壓至 30MPa以上，打開(kāi)出口閥，使菌體懸浮液經(jīng)閥門(mén)流出，出口處壓力突然降為常壓，由于膨脹而使細(xì)胞破碎。 壓力差破碎法 ? （ 3）滲透壓差法是利用滲透壓的變化而使細(xì)胞破碎。由于細(xì)胞外滲透壓突然降低，而使細(xì)胞破碎，將細(xì)胞中的酶等物質(zhì)釋出胞外。可用于從海洋微生物中提取某些酶。 ? 利用超聲波的機(jī)械振動(dòng)而使細(xì)胞膜上所受張力不均而破碎。 ? 常用的試劑可分為有機(jī)溶劑和表面活性劑兩大類。 ? 常用的有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。 ? 在酶的提取方面一般采用非離子型的 Triton、Tween等表面活性劑。 酶學(xué)破碎法 ? 在一定條件下，通過(guò)外加的酶或細(xì)胞本身存在的酶的作用，使細(xì)胞破碎。 ? 如溶菌酶能專一作用于肽多糖的 β1， 4糖苷鍵，常用于 G+ 菌的細(xì)胞破碎。 ? 幾丁質(zhì)酶用于霉菌的細(xì)胞破碎 ? 纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶往往混合使用，作用于植物細(xì)胞的細(xì)胞壁。 ? 必要進(jìn)可加入甲苯、氯仿、疊氮鈉等殺菌劑 ? 此外可通過(guò)加入噬菌體去感染細(xì)胞，或通過(guò)電離輻射等方法，使細(xì)胞自溶。丙酮處理一方面能有效地破壞細(xì)胞壁，另一方面有利于除去大量的脂類雜質(zhì)，同時(shí)還能使某些膜結(jié)合酶易于溶解。 酶的抽提（萃取、提取） ? 酶的抽提是指在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑中的過(guò)程。 ? 酶抽提時(shí)首先應(yīng)根據(jù)酶的性質(zhì)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)某樘嵋骸? 抽提劑 ? 由于大多數(shù)酶屬于球蛋白類，一般都溶于稀鹽、稀酸或稀堿溶液。 抽提劑的組成 ? 破碎生物組織一般在適當(dāng)?shù)木彌_液中進(jìn)行，典型的抽提劑由以下幾部分組成： ? 離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑（如 KCl, NaCl,蔗糖） 最普通的有~， 。沉淀法可濃縮并去除部分雜質(zhì)，此外，濃縮的方法有 ? （ 1）蒸發(fā)法 ? （ 2）反復(fù)凍融法 ? （ 3）膠過(guò)濾 ? （ 4）超濾法 ? 除去大分子的核酸和粘多糖 ? （ 1）加硫酸鏈霉素、聚乙烯亞胺、魚(yú)精蛋白或MnCl2可使核酸沉淀移去。 ? （ 2）常用醋酸鉛、乙醇、單寧和離子型表面活性劑等處理解決，有時(shí)也用酶。 酶的分離純化方法 ? 現(xiàn)有的酶的分離純化方法都是根據(jù)酶和雜蛋白在下列性質(zhì)上的差異建立的。 ? 鹽析法根據(jù)的原理是：球蛋白在低鹽濃度的溶液中，溶解度隨鹽離子強(qiáng)度升高而增大，表現(xiàn)“鹽溶 (salting in)”的特性。鹽析純化法就是根據(jù)酶和雜蛋白在高鹽濃度的溶液中溶解度差別差別而建立的一種純化方法。 ? 鹽析法應(yīng)控制 pH使接近等純化酶的等電點(diǎn)。 ? 此法優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便，安全，重現(xiàn)性好 ? 缺點(diǎn)：分辨率低，純度提高不顯著，同時(shí)為了下一步純化，有時(shí)還需要脫鹽。 ? 這種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是純化量大，重復(fù)性好，分辨率高較。 ? 在一定的鹽和離子強(qiáng)度條件下（ Ks、 I為常數(shù) ），通過(guò)改變溫度或 pH值使不同物質(zhì)分離，稱 ?分段鹽析。利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機(jī)溶劑中溶解度差異而分離的方法稱有機(jī)溶劑沉淀法。 ? 缺點(diǎn)：溫度控制不當(dāng)時(shí)易引起變性。除丙酮外，乙醇和甲醇等也常用。 共沉淀法 例子 ? 以聚乙烯亞胺 (polyethylenimine, PEI)純化限制性內(nèi)切核酸酶 RE. EcoR I為例。 PEI在 下，能和 DNA以及與之相關(guān)的蛋白質(zhì)一起凝聚沉淀析出；但當(dāng) KCl的濃度上升至 mol/L時(shí)，雖然 PEI與 DNA及雜蛋白仍處于沉淀狀態(tài)，而 RE. EcoR I卻能重新溶解，因此可將酶和雜蛋白分離開(kāi)來(lái)，使 RE. EcoR I得到初步純化。 ? .,PAA對(duì)某些蛋白酶、磷酸酯酶和溶菌酶等有選擇性沉淀效果： ? PAA+酶 PAA酶 ↓ ? PAA酶 +Ca2+ PAACa ↓+酶 +2H+ ? PAACa ↓+SO42 CaSO4 ↓+PAA 五、等電點(diǎn)沉淀法 ? 等電點(diǎn)沉淀根據(jù)的原理是，蛋白質(zhì)的溶解度隨分子間引力增大而變小，當(dāng)其他條件相同時(shí)，分子間的引力在蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)狀態(tài)最大，因而容易沉淀析出。 等電點(diǎn)沉淀法 ? 如：純化動(dòng)物材料抽提液中的酶時(shí)，可將pH先調(diào)整至 5左右，待放置片刻后，核蛋白等顆粒雜質(zhì)就會(huì)沉淀析出，使酶溶液達(dá)到“一步澄清”。 ? 調(diào)整溶液的 pH時(shí)應(yīng)選用具有相同離子的酸或堿緩沖液。 ? 通過(guò)選擇兩相系統(tǒng)中多聚物的種類與濃度、系統(tǒng)的 pH、 離子和離子強(qiáng)度以及溫度，就有可能使酶和雜蛋白達(dá)到很好的分離。 雙相水溶液分離法 (aqueous twophase separation) ? 以聚乙二醇 (PEG)和右旋糖酐形成的兩相系統(tǒng)為例。分配系數(shù) K=C上 /C下 ? 酶和蛋白質(zhì)的Ｋ通常介于 。 ? 把適當(dāng)?shù)哪z顆粒裝填成色譜柱，當(dāng)欲分離的物質(zhì)通過(guò)柱時(shí)，分子量不同的物質(zhì)在柱中的流動(dòng)受到固定相的阻滯作用不同，分子量大的只能沿溶脹的凝膠顆粒間的空隙隨溶劑流動(dòng)，移動(dòng)速度較快，先流出柱外，分子量小的可滲入凝膠網(wǎng)孔而受阻滯，流程長(zhǎng)，移動(dòng)速度慢，遲流出色譜柱。柱長(zhǎng) :直徑 20:1至100:1 凝膠色譜 ? A 分子直徑 最大孔徑，全排出 ? B 最小孔徑 分子直徑 最大孔徑 能進(jìn)入部分凝膠的內(nèi)孔隙 ? C 分子直徑 最小孔徑 能進(jìn)入凝膠的全部?jī)?nèi)孔隙 ? A、 C類不能分離， B類可分級(jí)分離 二、膜分離技術(shù) ? 原理：利用膜的借助于一定孔徑的各種高分子薄膜，將不同大小、不同性狀和不同特性的物質(zhì)顆粒或分子分離的技術(shù)，統(tǒng)稱為膜分離技術(shù)。 ? 操作壓力： 50~700kPa， 超濾膜截留的顆粒直徑2~200nm， 相當(dāng)于分子量 1~500kD。 ? 在酶的提取和分離純化過(guò)程中，細(xì)胞的收集、細(xì)胞碎片和沉淀的分離以及酶的純化等往往要使用離心分離。超離心法只能處理小體積的試樣，主要用于病毒、細(xì)胞顆粒等的制備，對(duì)分子量較小的酶或蛋白質(zhì)分離效果一般不佳。這是利用樣品中待純化分子和雜質(zhì)分子與吸附劑間吸附能力與解吸性質(zhì)不同而建立的分離純化方法。對(duì)于后者，混合物隨流動(dòng)相通過(guò)由吸附劑組成的固定相時(shí)由于 吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的不同吸附力 而使混合物分離。 吸附色譜 ? 根據(jù)吸附機(jī)制不同，吸附劑可分為三種類型：物理吸附劑、羥基磷灰石吸附劑和離子交換吸附劑。 ? 正吸附：吸附所需要的蛋白質(zhì) ? 影響吸附、洗脫的的主要因素： ? pH 正吸附在較低的 pH下進(jìn)行 負(fù)吸附可在較高的 pH及離子強(qiáng)度下進(jìn)行 ? 離子強(qiáng)度 低鹽濃度有利于吸附 ? 蛋白質(zhì)濃度 1%以減少蛋白質(zhì)間的相互作用， 利于吸附。 3. 離子交換色譜 ? 這是根據(jù)物質(zhì)的酸堿度、極性和分子大小的差異而予以分離的技術(shù)，包括吸附、吸收、穿透、擴(kuò)散、離子交換、離子親和力等物理化學(xué)過(guò)程，在實(shí)際應(yīng)用中常根據(jù)使用目的靈活地突出上述作用中的某一個(gè)，使之起主導(dǎo)作用。 ? 洗脫：通過(guò)控制 pH、 離子強(qiáng)度，使靜電引力下降。 （四）離子交換色譜的適用范圍 ? 離子交換色譜既可在大規(guī)模水平也可在小規(guī)模水平上進(jìn)行，幾乎所以的酶 /蛋白質(zhì)都可用此法分離、分辨率高。 ? 一般酶都要經(jīng)過(guò)多步的離交色譜、凝膠色譜等才能達(dá)到所要求的目的。 ? 自由界面電泳 ? 區(qū)帶電泳 膜電泳，粉末電泳，膠電泳 ? 等電聚焦電泳 紙電泳 ? （一）凝膠電泳 ? 凝膠電泳是以各種具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔凝膠作為支持體的電泳技術(shù)。 ? （二）等電聚焦 ? 在電解槽中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)即形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極逐步增加的 pH梯度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)放進(jìn)此體系時(shí)，不同的蛋白質(zhì)即移動(dòng)到或聚集于與其相當(dāng)?shù)牡入婞c(diǎn) pH位置上，不再移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。 電泳分離法 聚丙烯酰胺凝膠 (PAG) DISC電泳 (Discontinous electrophoresis) ? 在細(xì)玻璃管中制成雙層聚丙烯酰胺凝膠，用不連續(xù)的緩沖液系統(tǒng)進(jìn)行電泳，試樣在開(kāi)始時(shí)即會(huì)濃縮成極薄的層狀。 ? 一般電泳中，遷移率 m∝ q/f， q顆粒電荷，f摩擦系數(shù)。 ? SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳因此可用于蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定。 ? 原理： ? 當(dāng)用特定的多緩沖液（ polybuffer,PB） I滴定和淋洗填裝在色譜柱中的特定多緩沖交換劑（ polybuffer exchanger,PBE） 時(shí)，隨著這種緩沖液的擴(kuò)展，就會(huì)在色譜柱中自上而下建立起連續(xù)的 pH梯度，而該色譜柱中的蛋白質(zhì)也將隨 PB的擴(kuò)展按各自的 pI聚焦于相應(yīng)的 pH區(qū)段，并隨擴(kuò)展過(guò)程 pH梯度的逐漸下移而下移，最后分別從色譜柱先后洗出，達(dá)到分離純化的目的。 ? 聚焦色譜的實(shí)驗(yàn)流程： ? 1)根據(jù)樣品等電點(diǎn)選擇適宜的多緩沖交換劑和多緩沖液； ? 2)調(diào)整起始緩沖液 pH至梯度上限，以該緩沖液平衡多緩沖交換劑，裝柱； ? 3)調(diào)整多緩沖液 pH至梯度下限，以此緩沖液5~10 ml 流過(guò)柱； ? 4)加樣，以調(diào)整至梯度下限的多緩沖液擴(kuò)展、洗脫；分部收集并檢測(cè)洗脫液； ? 5)多緩沖交換劑的再生與平衡 聚焦色譜 ? 為了獲得較好的分離效果，有一個(gè)選擇適宜的色譜介質(zhì)與操作條件問(wèn)題。 Pharmacia公司專門(mén)生產(chǎn)了相