【正文】 析時(shí)，常用飽和度表示濃度 定義：溶液中加入飽和硫酸銨的體積與混合溶液總體積之比。 等電點(diǎn)沉淀法 ? 原理：利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低和不同的電解質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)的特性，通過調(diào)節(jié)溶液的 PH，使酶或蛋白質(zhì)沉淀析出，從而使酶和蛋白質(zhì)分離的方法。在實(shí)際中，此法經(jīng)常與其他方法一起使用，如等電點(diǎn)經(jīng)常與鹽析沉淀，有機(jī)溶劑沉淀，和復(fù)合沉淀一起使用。 ? 加酸堿時(shí)，一邊攪拌一邊慢慢加進(jìn)，防止局部過酸過堿一起蛋白質(zhì)變性。 ? 原理：有機(jī)溶劑的存在會(huì)使溶液的介電常數(shù)降低。 ? 常用的有機(jī)溶劑：乙醇，丙酮，異丙醇，甲醇 ? 影響因素：用量和 PH（最好等電點(diǎn)附近） ? 優(yōu)缺點(diǎn)：比鹽析的沉淀易于離心或過濾；不含無機(jī)鹽，分辨率高，但易引起酶變性失活，所以必須在低溫下操作，沉淀析出后盡快分離，盡量減少有機(jī)溶劑對(duì)酶活力的影響。 ? 常用的復(fù)合沉淀劑：單寧，聚乙二醇，聚丙烯酸 ? 例： 菠蘿蛋白酶與單寧復(fù)合可以制成藥片，用于治療咽喉炎 ? 復(fù)合物有的可以直接中使用，有的用適當(dāng)?shù)姆椒?，使酶從?fù)合物中析出進(jìn)一步純化。 ? 方法：熱處理，改變 PH或加入某些金屬離子 ? 應(yīng)用此法必須對(duì)與分離的酶以及酶液中的雜蛋白的種類含量及其物理和化學(xué)性質(zhì)有較全面的了解。 2 高速離心機(jī) 最大轉(zhuǎn)速在（ 1~） *104r/min,相對(duì)離心力達(dá)到 1*104~1*105g,在酶的分離中主要用于沉淀，細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等的分離。 3超速離心機(jī) 轉(zhuǎn)速能達(dá)到（ ~12） *104r/min,相對(duì)離心力能達(dá)到 5*105甚至更高。超速離心機(jī)可分為制備用超速離心機(jī)，分析用超速離心機(jī)和分析 — 制備兩用超速離心機(jī)。 主要用于大小和密度相差較大的顆粒，操作簡單方便，但分離效果較差，沉淀物中含有較多雜質(zhì)，沉淀在離心管的底部受到擠壓。 3 等密度梯度離心 當(dāng)欲分離的不同顆粒的密度范圍在介質(zhì)密度范圍之內(nèi)，在離心力的作用下，不同浮力密度的顆?；蛳蛳鲁两担蛳蛏掀?，只要時(shí)間足夠長，就能移動(dòng)到與它們各自密度相等的位置（等密度點(diǎn)），形成區(qū)帶，這種方法叫做等密度離心或稱平衡等密度離心。 ㈢ 離心 適當(dāng)?shù)卦黾与x心速度縮短離心時(shí)間，減少擴(kuò)少散導(dǎo)致的區(qū) 帶擴(kuò)寬現(xiàn)象。而等密度分離欲要求欲分離的顆粒處于密度梯度的等密度點(diǎn)。 ? 常用的離心介質(zhì) 氯化銫 硫酸銫 溴化銫 三碘苯的衍生物 過程 1 密度介質(zhì)和樣品結(jié)合 2 離心 注意： 銫鹽對(duì)鋁合金轉(zhuǎn)子具有極強(qiáng)的腐蝕作用，防止銫鹽溶液濺到轉(zhuǎn)子上，用完后將轉(zhuǎn)子仔細(xì)清洗和干燥。 離心條件的確定 離心條件 離心力 離心時(shí)間 溫度和 PH 離心力 ? 低速離心一般用轉(zhuǎn)速，即轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示，如 5000r/特別是超速離心時(shí)，往往以相對(duì)離心力（ RCF）表示，如 力是顆粒所受到的離心力與地心的引力的比值。 FC為離心力； F g為地心引力 。r為旋轉(zhuǎn)半徑（ cm). 一般離心力的數(shù)值是平均數(shù)值，即在離心溶液中點(diǎn)處顆粒所受的離心力。 ? 對(duì)于密度梯度離心而言，離心時(shí)間是指形成界限分明的區(qū)帶時(shí)間，稱為區(qū)帶形成時(shí)間。其中最常用的是沉降時(shí)間。 ? t表示沉降時(shí)間（ s) 。 w表示轉(zhuǎn)子的角速度（ r ad /s)。但在超速離心和高速離心時(shí)，由于轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)會(huì)發(fā)熱而引起溫度升高，必須采用冷凍裝置，使溫度維持在一定范圍內(nèi)。 5 過濾和膜分離 ? 過濾是借助過濾介質(zhì)將不同大小，不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。 ? 根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同，過濾可分為粗濾，微濾，超濾和反滲透 過濾的分類及其特性 類別 截留顆粒的大小 截留的主要物質(zhì) 過濾介質(zhì) 粗濾 2181。m 細(xì)菌 灰塵等 微濾膜 微孔陶瓷等 超濾 20197。 生物小分子，鹽，離子 反滲透膜 非膜過濾 ? 定義：采用高分子膜以外的材料，如濾紙，濾布，多孔陶瓷，纖維，燒結(jié)金屬等作為過濾介質(zhì)的分離技術(shù)稱為非膜過濾，包括粗濾和部分微濾 ? 粗濾：借助于過濾介質(zhì)截留懸浮液中直徑大于 2181。 ? 粗濾應(yīng)用范圍： 酵母 霉菌 動(dòng)植物細(xì)胞 培養(yǎng)基殘?jiān)? 大 顆粒固形物 ? 粗濾介質(zhì) ： 濾紙 濾布 纖維 多孔陶瓷 燒結(jié)金屬 ? 助濾劑 ： 硅藻土 活性炭 紙粕 ? 推動(dòng)力 ： 常壓過濾 加壓過濾 減壓過濾 粗濾 1 常壓過濾 以液位差為推動(dòng)力的過濾方法 過濾設(shè)備簡單，操作易行方便，但過濾速度慢分離效果差 2 加壓過濾 以壓力泵或壓縮空氣產(chǎn)生的壓力為推動(dòng)力的過濾方法。 微濾 ? 定義：又稱微孔過濾。m。 ? 一般采用微孔陶瓷，燒結(jié)金屬等作為過濾介質(zhì)，也可用微濾膜。 ? 常用膜 丙烯腈 醋酸纖維素 賽璐玢 尼龍 動(dòng)物膜 硝酸纖維素膜 ? 實(shí)例：核糖體結(jié)合ＴＲＮＡ來確定遺傳密碼（硝酸纖維素的應(yīng)用） ? 膜分離技術(shù)包括（薄膜的原理和推動(dòng)力） 1加壓膜分離 2電場膜分離 3擴(kuò)散膜分離 加壓膜分離 加壓膜分離 定義：以薄膜兩邊的流體靜壓差為推動(dòng)力的膜分離 技術(shù)。 截留顆粒在 ~2181。例如：無菌水除菌，酶液除微生物細(xì)胞 2超濾 定義：借助于超濾膜將不同大小的物質(zhì)顆粒或分子分離的方法。用于分離病毒和各種大分子。 注意：超濾濃度不要太高。 3反滲透 反滲透的孔徑小于 20197。 電場膜分離 ? 定義：電場膜分離是在半透膜兩側(cè)分別裝上正負(fù)極，在電場的作用下，帶電的小分子或者離子向與它們所帶電荷相反的方向移動(dòng)，透過半透膜達(dá)到分離的目的。用于凝膠電泳后含有的蛋白質(zhì)或核酸的凝膠帶電荷大分子的分離。 擴(kuò)散膜分離 ? 定義：利用小分子的擴(kuò)散作用，不斷使小分子透過半透膜擴(kuò)散到膜外，而大分子被截留，從而達(dá)到分離的效果。其中一個(gè)相是固定相，另一個(gè)相是流動(dòng)相。 層析分離 吸附層析 分配層析 離子交換層析 層析聚焦 凝膠層析 親和層析 層析分離方法 層析方法 分離原理 吸附層析 利用吸附劑對(duì)不同的物質(zhì)吸附能力不同而使混合物各組分分離 分配層析 利用不同的物質(zhì)在兩相的分配系數(shù)不同而使各組分分離 離子交換層析 利用離子交換劑上的可解離集團(tuán)（活性集團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的 凝膠層析 以多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中各組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到分離的目的 親和層析 利用生物分子與配基專一而又可逆的親和力力，使生物分子分離純化 層析聚焦 將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)的特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離 吸附層析 定義：利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合