【正文】 》 。 6．科、室負(fù)責(zé)人督促本制度嚴(yán)格執(zhí)行，根據(jù)情況給于獎(jiǎng)懲，出現(xiàn)問(wèn)題立即報(bào)告，造成病原擴(kuò)散等責(zé)任事故者，應(yīng)視情節(jié)直至追究法律責(zé)任。初步熟悉實(shí)驗(yàn)操作的主要步驟和環(huán)節(jié)，對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的安排做到先后有序、有條不紊和避免差錯(cuò)。實(shí)驗(yàn)前要洗手，以減少染菌的概率。為此，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每個(gè)人要嚴(yán)格做到以下幾點(diǎn)： ?操作時(shí)要預(yù)防空氣對(duì)流：在進(jìn)行微生物實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，要關(guān)閉門窗，以防空氣對(duì)流。 ?含菌器具要消毒后清洗：凡用過(guò)的帶菌移液管、滴管或涂布棒等，在實(shí)驗(yàn)后應(yīng)立即投入 5%石炭酸或其他消毒液中浸泡 20min，然后再取出清洗，以免污染環(huán)境。 ?要穿干凈的白色工作服：微生物學(xué)工作者在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)穿上白色工作服，離開(kāi)時(shí)脫去，并經(jīng)常洗滌以保持清潔。 ?實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙，不準(zhǔn)吃東西，切忌用舌舔標(biāo)簽、筆尖或手指等物，以免感染。 ?各種儀器應(yīng)按要求操作，用畢按原樣放置妥當(dāng)。值日生負(fù)責(zé)打掃實(shí)驗(yàn)室及進(jìn)行安全檢查 (門窗、水、電及煤氣等 ) 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) ? 冷靜處理意外事故： ? 打碎玻璃器皿：如遇因打碎玻璃器皿而把菌液灑到桌面或地上時(shí)，應(yīng)立即以 5%石炭酸液或%新潔爾滅溶液覆蓋， 30min后擦凈。 ? 菌液污染手部皮膚：先用 70%乙醇棉花拭凈，再用肥皂水洗凈。 ? 菌液吸入口中：應(yīng)立即吐出，并用大量自來(lái)水漱口多次，再根據(jù)該菌的致病程度作進(jìn)一步處理： ? 非致病菌：用 ％高錳酸鉀溶液漱口。 ? 致病菌：如吸入白喉棒桿菌，在用②法處理后，在注射 1000U白喉抗毒素作緊急預(yù)防；若吸入傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌或霍亂弧菌等腸道致病菌，在經(jīng)②法處理后，可注射抗生素預(yù)防發(fā)病。 ? 皮膚燙傷：可用 5％鞣酸、 2％苦味酸（苦味酸氨苯甲酸丁酯油膏）或 2％龍膽紫液涂抹傷口。 ? NaOH、金屬鈉（鉀）、強(qiáng)堿性藥劑：先用大量清水洗滌，再用 5％硼酸或 5％乙酸中和 ? 石炭酸：用 95％乙醇洗滌 ? 如遇眼睛灼傷：則應(yīng)先用大量清水沖洗，再根據(jù)化學(xué)品的性質(zhì)作分別處理，例如，遇堿灼燒可用 5％硼酸洗滌，遇酸灼燒可用 5％ NaHCO3洗滌，在此基礎(chǔ)上再滴入 1～ 2滴橄欖油或液體石蠟加以潤(rùn)濕即可。根據(jù)企業(yè)規(guī)模和產(chǎn)品種類，應(yīng)建設(shè)不同要求的化驗(yàn)室。這樣有助于儀器設(shè)備的合理擺放，便于操作，便于樣品流通和空氣流通。 （ 3）室內(nèi)必須配置干粉或二氧化碳滅火器，以備電器或化學(xué)品燃燒滅火使用。有條件的還應(yīng)在地面鋪設(shè)絕緣膠板。 ? 室內(nèi)的布局 (1)動(dòng)儀器與靜儀器分開(kāi)：精密儀器（如光度計(jì)、天平、比色計(jì)、酸度計(jì)、色譜儀等）應(yīng)必須與震動(dòng)儀器（如震蕩器、驗(yàn)粉篩、離心機(jī)、攪拌器等）。 (3)化學(xué)分析臺(tái)與熱源設(shè)備分開(kāi)：化學(xué)分析臺(tái)面上應(yīng)盡量少放易燃和腐蝕性試劑。化學(xué)分析臺(tái)的擺放應(yīng)遠(yuǎn)離熱源設(shè)備。日后要定期熏蒸； ? 每?jī)尚瞧谟镁凭耷虿潦米贤饩€燈管； ? 每次使用無(wú)菌室前用紫外燈照射 30～ 60分鐘； ? 每次使用完無(wú)菌室后，要及時(shí)用 3%的煤酚皂擦洗工作臺(tái)面及地面。 ? 接通電源，提前 50分鐘打開(kāi)紫外燈照射消毒，處理凈化工作區(qū)內(nèi)工作臺(tái)表面積累的微生物， 30分鐘后，關(guān)閉紫外燈，開(kāi)啟送風(fēng)機(jī) ? 工作臺(tái)面上，不要存放不必要的物品，以保持工作區(qū)內(nèi)的潔凈氣流不受干擾 ? 操作結(jié)束后，清理工作臺(tái)面，收集各廢棄物，關(guān)閉風(fēng)機(jī)及照明開(kāi)關(guān)，用清潔劑及消毒劑擦拭消毒。 ? 每二月用風(fēng)速計(jì)測(cè)量一次工作區(qū)平均風(fēng)速，如發(fā)現(xiàn)不符合技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)調(diào)節(jié)調(diào)壓器手柄，改變風(fēng)機(jī)輸入電壓，使工作臺(tái)處于最佳狀況。 ? 每次使用完畢，立即清潔儀器，懸掛標(biāo)識(shí)，并填寫儀器使用記錄。 微生物檢測(cè)作業(yè)規(guī)范 ?各培養(yǎng)液配制完成后，殺菌前放入冰箱冷藏保存，但必須在 48小時(shí)內(nèi)對(duì)其進(jìn)行分裝殺菌使用。同一培養(yǎng)液反復(fù)殺菌不超過(guò) 2次。 ?殺菌鍋密閉前，內(nèi)桶頂部覆蓋一層報(bào)紙。每次均做空白對(duì)比（除非有特殊說(shuō)明）。清理結(jié)束后，開(kāi)啟紫外燈殺菌 30分鐘。 ?口罩、衛(wèi)生帽每人次使用兩天，無(wú)菌間縫單日定期拖地、專用的工作衣每周定期清洗，具體人員由班長(zhǎng)另行安排。 ? 涂凡士林 ：取潔凈無(wú)油的蓋玻片 1塊，在其四周涂少量的凡士林。 ? 蓋凹玻片： 將凹玻片的凹槽對(duì)準(zhǔn)蓋玻片中央的菌液，并輕輕地蓋在蓋玻片上，使兩者粘合在一起，然后翻轉(zhuǎn)凹玻片，菌液正好懸在凹槽的中央，再用火柴棒輕壓蓋玻片使四周邊緣閉合，以防菌液干燥。由于菌體是透明的，鏡檢時(shí)可適當(dāng)縮小光圈或降低聚光器，以增大反差，便于觀察。若鏡檢好氧菌時(shí)，應(yīng)在水封片中留 1～ 2個(gè)小氣泡，然后再觀察氣泡四周細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力，否則因蓋玻片內(nèi)供氧不足而抑制了細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)。 不染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－注意事項(xiàng) ? 結(jié)果記錄 ? 注意事項(xiàng) ? 檢查細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的載玻片和蓋玻片都要潔凈無(wú)油，否則將影響細(xì)菌的運(yùn)動(dòng) ? 制水封片時(shí)，菌液不可加得太多，因過(guò)多的菌液會(huì)蓋玻片下流動(dòng)，從而影響了對(duì)細(xì)菌正常運(yùn)動(dòng)的觀察。降低菌液的 pH而使細(xì)菌帶陽(yáng)電時(shí)，就可用酸性染料染色。 ? 復(fù)合染料 ：堿性染料與酸性染料的結(jié)合物（伊紅美藍(lán)、伊紅天青）。若材料為液體培養(yǎng)物或自固體培養(yǎng)物中洗下制備的菌液，則可直接涂布于載玻片上。 ? 干燥： 涂布最好在室溫下使其干燥，有時(shí)為之使之干燥得快些，小心地在酒精燈火焰高處微微加熱。 注意事項(xiàng)： ? 載玻片要潔凈無(wú)油，否則菌液涂不開(kāi)，且固定效果不好，水洗時(shí)易被水沖掉。 ? 干燥時(shí)，切勿靠火焰太近或加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以防標(biāo)本烤枯而使菌體變形。該法簡(jiǎn)便易行，但僅能顯示細(xì)胞的外部形態(tài)，而不能辨別其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，適用于微生物的形態(tài)觀察。因?yàn)榧?xì)菌除了具有細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、原生質(zhì)和核等基本構(gòu)造外 ,某些細(xì)菌還具有莢膜、芽孢、鞭毛和異染顆粒等特殊結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)不能被一般染色方法著色，必須用特殊的方法才能著色。一般使用酸性染料，如剛果紅或水溶性苯胺黑。 負(fù)染色法除用于觀察細(xì)胞形態(tài)外，還可 區(qū)別死菌與活菌 ，因死菌可被酸性染料著色，部分自溶的細(xì)菌也能輕度染上酸性染料，而活菌卻不著色。 菌齡 ：選用培養(yǎng) 18～ 24h菌齡的細(xì)菌為宜。關(guān)于顏色你們?cè)趺创_定的？ （對(duì)照：當(dāng)確證一個(gè)未知菌的革蘭氏反應(yīng)時(shí)，應(yīng)同時(shí)做一張已知革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌的 混合圖片 ） ? 染色過(guò)程中勿使染色液干涸。 ? 用洗衣粉水煮沸、清洗、瀝干備用。芽孢染色采用弱堿性染料孔雀綠在加熱條件下進(jìn)行。因孔雀綠是弱堿性染料，與菌體結(jié)合力較差，因此易被水洗 掉，而進(jìn)入芽孢中的孔雀綠卻難以溶出。 方法與步驟 ? 制片：將培養(yǎng) 24小時(shí)的細(xì)菌涂片、干燥、固定 ? 染色：將孔雀綠染色液滴加 3～ 5滴于標(biāo)本上。在加熱過(guò)程中要隨時(shí)加染色液，切勿煮沸或使樣本干涸。 ? 水洗、干燥，置于油鏡下觀察并繪圖說(shuō)明。 ? 加染色液：加 5％孔雀綠染色液 2～ 3滴于小試管中，用接種環(huán)攪拌使染色液與菌液充分混合。 ? 涂片：用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌液于潔凈的玻片上，并涂成薄膜。 ? 脫色：用水洗，直至流出的水中無(wú)孔雀綠顏色為止。 ? 鏡檢：用油鏡觀察 結(jié)果紀(jì)錄 菌名 染色法 芽孢和菌體的顏色 圖示芽孢的形態(tài)、大小和著生位置 染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－芽孢染色法 注意事項(xiàng)： ? 供芽孢染色用的菌種應(yīng)控制菌齡，使大部分芽孢仍保留在菌體內(nèi)。 ? 改良法在節(jié)約染料、簡(jiǎn)化操作及提高標(biāo)本質(zhì)量等方面都較常規(guī)法優(yōu)越，可優(yōu)先使用。 染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－鞭毛染色法 鞭毛染色方法基本原理雷同，即在染料前先經(jīng)媒染劑處理，讓它沉積在鞭毛上，使 鞭毛直徑加粗，然后再進(jìn)行染色。取出稍冷后用自來(lái)水沖洗，晾干。使用前取出玻片，用自來(lái)水沖去殘酸，再用蒸餾水洗。過(guò)火去乙醇，立即使用。待溶解后，加 1％NaOH溶液 1ml和 15％甲醛溶液 2ml； B液： 硝酸銀 2g溶于蒸餾水 100ml中。在整個(gè)滴加過(guò)程中要邊滴邊加充分搖蕩。 ? 涂片 ：用接種環(huán)挑取數(shù)環(huán)菌液于玻片的一端，立即將玻片傾斜，讓菌液緩慢地流向另一端，用吸水紙吸去多余的菌液。 ? 染色：滴加 A液（ 4～ 6min) → 用蒸餾水充分洗凈 A液 → 用 B液沖去殘水，在用 B液于涂片上，用微火加熱至冒煙，維持 ～ 1min（加熱時(shí)應(yīng)隨時(shí)補(bǔ)充蒸發(fā)掉的染色，不可使玻片出現(xiàn)干涸區(qū) → 用蒸餾水洗，自然干燥。 染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－鞭毛染色法 Leifson氏染色法： ? 清洗玻片 ：同銀染法 ? 配制染色液： A液 ：堿性復(fù)紅 ， 95％乙醇 100ml； B液 ：鞣酸 3g，蒸餾水 100ml（如加 ％苯酚，可長(zhǎng)期保存）； c液： NaCl ，蒸餾水 100ml。使用前將上述溶液等體積混合，將混合液貯藏于封密性良好的瓶中，置冰箱中可保存數(shù)星期。 ? 菌液的制備及涂片 ：菌液的制備同銀染法 → 用記號(hào)筆在玻片的反面劃分 3～ 4個(gè)相等的區(qū)域 → 放 1環(huán)菌液于每個(gè)小區(qū)的一端，將玻片傾斜，讓菌液流向另一邊，并用濾紙吸去多余的菌液 → 在空氣中自然干燥。數(shù)隔分鐘后染料加入第二區(qū)，以后以此類推（相隔時(shí)間可自行決定），其目的是確定最合適的染色時(shí)間，且節(jié)約材料。 → 在沒(méi)有傾去染料的情況下，就用自來(lái)水輕輕地沖去染料，否則會(huì)增加背景的沉淀 → 自然干燥。 ? Leifson氏染色法受菌種、菌齡和室溫等因素的影響，要掌握好染色條件必須經(jīng)過(guò)一些摸索。 ? 細(xì)菌鞭毛極細(xì)，很容易脫落，在整個(gè)操作過(guò)程中，必須仔細(xì)小心。最后一代菌種放 37℃ 恒溫箱中培養(yǎng) 15~18h。將該試管放 37℃ 恒溫中靜置 10min（放置時(shí)間不宜太長(zhǎng)，否則鞭毛會(huì)脫落），讓幼齡菌的鞭毛松展開(kāi)。其主 要化學(xué)成分是多糖、多糖類物質(zhì)。通常采用負(fù)染色方法：使菌體和背景著色而莢膜在菌體周圍呈 一透明圈。 染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 －－莢膜染色法 ? 制片 ：在載玻片一端加一滴 6％葡萄糖液，取少許培養(yǎng) 72h的被檢樣菌與其充分混合，再滴一滴新配制的黑色素溶液（或墨汁），混勻。 角迅速而均勻地將菌液推向玻片另一端，將菌液涂成一薄膜，風(fēng)干。 ? 干燥、鏡檢： 背景成黑色，菌體呈紅色，莢膜無(wú)色 結(jié)果與討論 ? 按上述方法，在番茄紅之前，用甲醇固定 1min亦可； ? 按上述方法，用石炭酸復(fù)紅液代替蕃紅液，染色 2min，結(jié)果同上。然后用 20％ CuSO4 水溶液洗滌，干燥后鏡檢。 培養(yǎng)基制備技術(shù) 玻璃器皿的清洗 在制備培養(yǎng)基的過(guò)程中，首先要使用一些玻璃器皿，如試管、三角瓶、培養(yǎng)皿、燒杯和吸管等。有的還要進(jìn)行包裝，經(jīng)過(guò)滅菌等準(zhǔn)備就緒后，才能使用。對(duì)容量較大的器皿，如大燒瓶、量筒等，洗凈后注入濃鹽酸少許，轉(zhuǎn)動(dòng)容器使其內(nèi)部表面均沾有鹽酸，數(shù)分鐘后傾去鹽酸，再以流水沖凈，倒置于洗滌架上將水空干，即可使用。有可能被病原菌污染的器皿，必須經(jīng)過(guò)適當(dāng)消毒后，將污垢除去，用皂液洗刷，再用流水沖洗干凈。洗液的主要成份是重鉻酸鉀和濃流酸，其作用是將有機(jī)物氧化成可溶性物質(zhì)，以便沖洗。 培養(yǎng)基制備技術(shù) 培養(yǎng)基分類 ? 根據(jù)對(duì)培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學(xué)成分是否完全了解來(lái)區(qū)分： １）天然培養(yǎng)基 天然培養(yǎng)基是指利用各種動(dòng)、植物或微生物的原料，其成分難以確切知道。用這些物質(zhì)配成的培養(yǎng)基雖然不能確切知道它的化學(xué)成分，但一般來(lái)講，營(yíng)養(yǎng)是比較豐富的，微生物生長(zhǎng)旺盛，而且來(lái)源廣泛，配制方便，所以較為常用，尤其適合于配制實(shí)驗(yàn)室常用的培養(yǎng)基。 ２）合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是一類化學(xué)成分和數(shù)量完全知道的培養(yǎng)基，它是用已知化學(xué)成分的化學(xué)藥品配制而成。 ３）半合成培養(yǎng)基 在合成培養(yǎng)基中，加入某種或幾種天然成分；或者在天然培養(yǎng)基中，加入一種或幾種已知成分的化學(xué)藥品即成半合成培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基在生產(chǎn)實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)室中使用最多。 ２）固體培養(yǎng)基 在液體培養(yǎng)基中加入適量的凝固劑即成固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基在實(shí)際中用得十分廣泛。以瓊脂為例，它的用量在 ~1%之間。 培養(yǎng)基制備技術(shù) －－培養(yǎng)基的分類 ? 根據(jù)培養(yǎng)基的用途來(lái)區(qū)分： (1)通用培養(yǎng)基 ：培養(yǎng)異氧細(xì)菌最常用的培養(yǎng)基是牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；配制適合于厭氧菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基時(shí)，通常須在培養(yǎng)基中加入適量的還原劑如巰基醋酸鈉、維生素 C或半胱氨酸來(lái)降低培養(yǎng)基的氧化還原電位，以利于厭氧菌的生長(zhǎng)。 (伊紅－美藍(lán)瓊脂、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、亞硫酸鉍瓊脂、 微生物快速顯色培養(yǎng)基 ） (3)選擇性培養(yǎng)基 ：根據(jù)某微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)要求或?qū)δ郴瘜W(xué)、物理因素的抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，具有使混合菌樣中的劣勢(shì)菌變成優(yōu)勢(shì)菌。例如食品檢驗(yàn)中常用的麥康凱培養(yǎng)基是一例。膽鹽具有抑制腸道菌以外的細(xì)菌的作用（選擇性），乳糖和中性紅（指示劑）能幫助區(qū)別乳糖發(fā)酵腸道菌（如大腸桿菌）和不能發(fā)酵乳糖的腸道致病菌（如沙門氏菌和志賀氏菌）。使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋，以防有微量銅或鐵混入培養(yǎng)基中，使細(xì)菌不易生長(zhǎng) 。例如，牛肉浸液約可降低 ，而腸浸液 pH卻會(huì)有顯著的升高。 ? 一般培養(yǎng)基可采用 121176。在各種培養(yǎng)基制備方法中，如無(wú)特殊規(guī)定，即可用此法滅菌。明膠培養(yǎng)基亦應(yīng)用較低溫度滅菌。 C左右的培養(yǎng)基中。 滅菌和消毒 －－ 物理方法 ? 溫度 ：利用溫度進(jìn)行滅菌、消毒或防