分子標(biāo)記ssr標(biāo)記ppt課件-在線瀏覽
2025-06-23 08:13本頁面
【正文】 在此保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對特異的 PCR引物，擴(kuò)增其中的微衛(wèi)星序列，通過聚內(nèi)酞胺凝膠電泳，即可顯示出個(gè)體間在此位點(diǎn)的微衛(wèi)星序列的多態(tài)性。絕大多數(shù)作物，如大豆、水稻、小麥、玉米、大麥等中， SSR位點(diǎn)上的等位基因數(shù)目可多達(dá)十幾個(gè)乃至幾十個(gè)，個(gè)別作物多態(tài)性水平較低。 ? 對人類 SSR的研究表明， 核心序列的重復(fù)次數(shù)與 SSR的長度多態(tài)性 有密切關(guān)系。這一趨勢也在一些作物中得到證實(shí)。同一類型 SSR的不同位之間，其多態(tài)性水平也不一樣。由 AT重復(fù)構(gòu)成的 SSR甚至可區(qū)分遺傳基礎(chǔ)極其狹窄的日本梗稻育成品種。但因 (AT)n類型寡聚核苷酸探針容易形成二級結(jié)構(gòu)，降低了篩選效率，影響了這一類型 SSR的分離 .然而現(xiàn)有研究表明， (AT)n類型 SSR仍是可以分離的。 微衛(wèi)星標(biāo)記分離技術(shù) ? 為 了避免篩選文庫，現(xiàn)在有一些與其他成熟技術(shù)結(jié)合的分離微衛(wèi)星標(biāo)記的方法，包括 : ? （ 1）運(yùn)用 RAM P和 RA PD技術(shù)分離單位點(diǎn)微衛(wèi)星標(biāo)記 ? RAM P 利用 5’含有四個(gè)錨定堿基的微衛(wèi)星引物結(jié)合不同的 RA PD引物在基因組 DNA中擴(kuò)增，獲得片段包括兩頭帶反向微衛(wèi)星序列的擴(kuò)增片段 (為 USSR產(chǎn)物 )、隨機(jī)擴(kuò)增的片段 (RA P產(chǎn)物 )、隨機(jī)引物與微衛(wèi)星基因座間的片段 (SSR產(chǎn)物 ).用標(biāo)記的 5‘錨定引物擴(kuò)增或經(jīng) Southern 后在用標(biāo)記的微衛(wèi)星探針與之雜交后，再經(jīng)過自顯影，可以得到只含微衛(wèi)星標(biāo)記的指紋圖譜 .在 RAM P和 RAPD技術(shù)的基礎(chǔ)上，人們運(yùn)用 RAM P技術(shù)和 RA PD技術(shù)擴(kuò)增基因組 DNA，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，然后用標(biāo)記的微衛(wèi)星的探針與 PCR產(chǎn)物Southern雜交或用標(biāo)記微衛(wèi)星錨定引物，在 PCR擴(kuò)增后膠上直接觀測，選擇陽性條帶克隆 }22 i、或者首先克隆所有的 PCR產(chǎn)物，制成微列陣，然后篩選克隆。 539。錨定 PCR ( 5’anchored PCR)分離 SSR標(biāo)記 ? 采用的 5’帶有 六個(gè)簡并堿基 錨定的微衛(wèi)星序列引物 .這種引物錨定效果要比 1SSR技術(shù)中的隨機(jī)錨定引物的特異性好，避免了引物在微衛(wèi)星序列上的滑動 .然后用這個(gè)單引物在基因組 DNA中 擴(kuò)增 ，得到兩端帶有 反向 微衛(wèi)星序列 DNA片段，用 T載體 克隆 PCR產(chǎn)物，然后用Southern雜交 的方法，在高嚴(yán)謹(jǐn)度的條件下，獲得含微衛(wèi)星序列的克隆，然后對這些陽性克隆進(jìn)行 測序 ，根據(jù)獲得的序列，在微衛(wèi)星序列的側(cè)翼 設(shè)計(jì)引物 ，用 5‘錨定簡并引物結(jié)合微衛(wèi)星特異性引物，經(jīng)擴(kuò)增后獲得 單位點(diǎn)的 SSR標(biāo)記 . ? 也可以通過步查獲得微衛(wèi)星序列另一側(cè)的序列，并設(shè)計(jì)另一個(gè)引物，然后用成對的特異性引物來擴(kuò)增單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn) . 5’錨 定 PCR技術(shù)有兩個(gè)明顯的優(yōu)勢，其一，可以簡單而快捷地建立 SSR富集文庫 .第二，對于大多數(shù)位點(diǎn)僅僅需要一個(gè)特異性引物就可以獲得位點(diǎn)特異的共顯性標(biāo)
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