【正文】 蘭氏染色的機(jī)理 關(guān)于革蘭氏染色的機(jī)理有許多學(xué)說，目前一般認(rèn)為與細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成細(xì)胞壁的滲透性有關(guān)。這是由于革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁較厚，肽聚糖含量高且網(wǎng)格結(jié)構(gòu)緊密，脂類含量極低，8 / 118當(dāng)用酒精(或丙酮) 脫色時(shí)，引起肽聚糖層脫水，使網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的孔徑縮小，導(dǎo)致細(xì)胞壁的通透性降低，從而使結(jié)晶紫—碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，使菌體仍呈深紫色。所以，菌體經(jīng)番紅復(fù)染后呈紅色。是外側(cè)緊貼細(xì)胞壁，內(nèi)側(cè)包圍細(xì)胞質(zhì)的一層柔軟而富有彈性的半透性薄膜，厚度一般為7 nm ~8nm。細(xì)胞膜的基本結(jié)構(gòu)見圖24 。具有重要的生理功能，主要有：（1）選擇滲透性。（2）參與細(xì)胞壁各種組分的以及糖等的生物合成。在細(xì)菌中，電子傳遞和ATP 合成酶均位于細(xì)胞膜上。其主要成分為蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂類、水分和少量無機(jī)鹽類。細(xì)胞質(zhì)中無真核細(xì)胞所具有的細(xì)胞器，但含有許多內(nèi)含物，主要有核糖體、液泡和貯藏性顆粒。（1）核糖體。化學(xué)成分為蛋白質(zhì)（40%）和RNA（60%） 。是一類由不同化學(xué)成分累積而成的不溶性的沉淀顆粒。這些顆粒通常較大，并為單層膜所包圍，經(jīng)適當(dāng)染色可在光學(xué)顯微鏡下觀察到，它們是成熟細(xì)菌細(xì)胞在其生存環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)過剩時(shí)的積累，營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)又可被利用。一些細(xì)菌如無鞭毛運(yùn)動(dòng)的水生細(xì)菌，在生長(zhǎng)一段時(shí)間，在細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)幾個(gè)甚至更多的圓柱形或紡錘形氣泡。氣泡使細(xì)菌具有浮力，漂浮于水面，以便吸收空氣中的氧氣供代謝需要。它是由一條環(huán)狀雙鏈的DNA分子（脫氧核糖核酸）高度折疊纏繞而形成。以大腸桿菌為例，菌體長(zhǎng)度僅1181。m，而它的DNA長(zhǎng)度可達(dá)1100181。原核是重要的遺傳物質(zhì)，攜帶著細(xì)菌的全部遺傳信息。除染色體DNA外，很多細(xì)菌含有一種自我復(fù)制、穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的染色體外的遺傳因子——質(zhì)粒。根據(jù)其功能不同可分為三類：①致育因子(F因子)，與有性接合有關(guān)；② 抗藥性質(zhì)粒(R因子)，與抗藥性有關(guān)；③降解性質(zhì)粒，與降解污染物有關(guān)。質(zhì)粒的有無與細(xì)菌的生存無關(guān)。某些細(xì)菌在新陳代謝過程中產(chǎn)生的覆蓋在細(xì)胞壁外的一層疏松透明的粘液狀物質(zhì)(見圖 25)。莢膜使細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上形成光滑型菌落。具有一定的外形、厚約 200 nm，較穩(wěn)定地附著于細(xì)胞壁外，并且與環(huán)境有明顯的邊緣。沒有明顯的邊緣且擴(kuò)散在環(huán)境中。若許多細(xì)菌的莢膜物質(zhì)相互融合，使菌體連為一體。莢膜的形成與否主要由菌種的遺傳特性決定，也與其生存的環(huán)境條件有關(guān)。產(chǎn)生莢膜的細(xì)菌并不是在整個(gè)生活期內(nèi)都能形成莢膜，如某些鏈球菌在生長(zhǎng)早期形成莢膜，后期則消失。莢膜的主要功能有：① 保護(hù)作用。營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)可作為細(xì)胞外碳(或氮)源和能源的貯存物質(zhì)；③表面吸附作用。④作為透性屏障。莢膜折光率很低，不易著色，必須通過特殊的莢膜染色法，即使背景和菌體著色，襯托出無色的莢膜，才可在光學(xué)顯微鏡下觀察到。腸膜明串珠菌是制糖工業(yè)的有害菌，常在糖液中繁殖，使糖液變得黏稠而難以過濾，因而降低了糖的產(chǎn)量。再利用葡聚糖來生產(chǎn)右旋糖酐，作為代血漿的主要成分。 芽孢是細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)。又叫內(nèi)生孢子。如一般細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在70℃~80 ℃時(shí) 10min就死亡，而在沸水中，枯草芽孢桿菌的芽孢可存活1h，破傷風(fēng)芽孢桿菌的芽孢可存活3h，肉毒梭菌的芽孢可忍受6小時(shí)。細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在5%苯酚溶液中很快死亡，芽孢卻能存活15d。因此在微生物實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵中常以是否殺死芽孢作為殺菌指標(biāo)。一般的芽孢在普通條件下可保存幾年至幾十年的活力。芽孢之所以具有較強(qiáng)的抗逆境能力與其含水量低(38%~40%)、壁厚而致密(分三層 )、芽孢中 2,6吡啶二羧酸含量高以及含耐熱性酶等多種因素有關(guān)。故芽孢只是休眠體而非常繁殖體。芽孢在細(xì)胞中的位置、形狀與大小因菌種不同而異，是分類鑒定的重要依據(jù)之一。12 / 118而破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌的芽孢則位于細(xì)胞一端，且直徑大于細(xì)胞寬度，呈鼓槌狀。圖 26 芽孢的形態(tài)和著生位置(從左至右依次為 近中央、末端、中央 )芽孢的結(jié)構(gòu)主要由孢外壁、芽孢衣、皮層和核心組成。其中芽孢核心是原生質(zhì)部分，含 DNA、核糖體和酶類。因而成熟的芽孢結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是含水少、壁致密、含大量的抗性物質(zhì)。細(xì)菌能否形成芽孢除遺傳因素外，與環(huán)境條件如氣體、養(yǎng)分、溫度、生長(zhǎng)因子等密切相關(guān)。少數(shù)菌種如蘇云芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）則在營(yíng)養(yǎng)豐富、溫度、氧氣均適宜時(shí)形成芽孢。 圖27 芽孢的結(jié)構(gòu)模式 13 / 118鞭毛細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)。鞭毛起源于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，直徑1218nm，長(zhǎng)度可超過菌體的數(shù)倍到幾十倍。大多數(shù)的球菌沒有鞭毛；桿菌有的生鞭毛，有的不生鞭毛；螺旋菌一般都有鞭毛。鞭毛的結(jié)構(gòu)由鞭毛基體、鞭毛鉤和截毛絲三部分組成。鞭毛是負(fù)責(zé)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的結(jié)構(gòu)，一般幼齡細(xì)菌和有水的適溫環(huán)境中能進(jìn)行活躍的運(yùn)動(dòng)，衰老菌常因鞭毛脫落而運(yùn)動(dòng)不活躍。細(xì)菌鞭毛的著生類型如圖28。下面列出了某些細(xì)菌鞭毛的著生類型。是某些革蘭氏陰性菌和少數(shù)革蘭氏陽性菌芽孢桿菌科：枯草桿菌( Bacillus subtilis)一根：霍亂弧菌(Vibrio cholorae)一束：熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)一根：鼠 咬 熱 螺 旋 體 (Spirochaeta morsusmuris)一束：紅色螺菌(Spirillum rubrum)一端生兩端生端生生腸桿菌科：大腸桿菌( Escherichia coli)周生生鞭毛的類型14 / 118細(xì)胞上但出的數(shù)目較多、短而直的蛋白質(zhì)絲或細(xì)管。不是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官。纖毛有兩種：一種是普通纖毛，能使細(xì)菌粘附在某物質(zhì)上或液面上形成菌膜；另一種是性纖毛，又稱性菌毛（F菌毛） ，它比普通菌毛長(zhǎng)，數(shù)目較少，為中空管狀，一般常見于 G菌的雄性菌株中，其功能是細(xì)菌接在接合作用時(shí)向雌性菌株傳遞遺傳物質(zhì)。二、細(xì)菌的形態(tài)與排列方式 （一）細(xì)菌的形態(tài)細(xì)菌種類繁多，就單個(gè)菌體而言，細(xì)菌有三種基本形態(tài)：球狀、桿狀、螺旋狀，分別稱球菌、桿菌、螺旋菌。在一定條件下，各種細(xì)菌通常保持其各自特定的形態(tài)，可作為分類和鑒定的依據(jù)。1. 球菌（Coccus） 是一類菌體呈球形或近似球形的細(xì)菌，按分裂后細(xì)胞的排列方式不同，可分為6種不同的排列方式。又稱微球菌或小球菌。如尿素小球菌 （Micrococcus ureae）.（2）雙球菌。如肺炎雙球菌(Diplococcus pneumoniae).（3）鏈球菌。如乳鏈球菌（Streprococcus lactis ） 。細(xì)菌在兩個(gè)相互垂直的平面上分裂，分裂后每四個(gè)菌體呈正方形排列在一起，如四聯(lián)小球菌（Micrococcus tetragenus ） 。細(xì)菌在三個(gè)相互垂直的平面分裂，分裂后每八個(gè)菌體在一起成立方體排列。（6）葡萄球菌。如金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 。各種桿菌的長(zhǎng)短、大小、粗細(xì)、彎曲程度差異較磊，有長(zhǎng)桿菌、桿菌和短桿菌。15 / 118桿菌在培養(yǎng)條件下，有的呈單個(gè)存在，如大腸桿菌(Escherichiacoli. E. coli)；有的呈鏈狀排列，如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；有的呈柵狀排列或“V”排列，如棒狀軒菌（Corynebacterium） 。根據(jù)其彎曲程度不同可分成弧菌與螺菌兩各類型，（1）弧菌。（2）螺旋菌。： 2 鏈球菌 3. 四聯(lián)球菌 5葡萄球菌 ：（端鈍圓） （菌體稍彎） 8 短桿菌 （端尖） （端鈍圓和平截）： 在正常生長(zhǎng)條件下，不同種的細(xì)菌形態(tài)是相對(duì)穩(wěn)定的。即使在同一培養(yǎng)基中，細(xì)胞也常出現(xiàn)不同大小的球狀、長(zhǎng)短不一的桿狀及不規(guī)則的多邊形態(tài)。一般在幼齡階段或生長(zhǎng)條件適宜時(shí)，細(xì)菌形態(tài)正常表現(xiàn)出自身特定的形態(tài)，在較老的菌齡或不正常的培養(yǎng)條件下，細(xì)菌16 / 118常出現(xiàn)不正常的形態(tài)。m)作為測(cè)量其長(zhǎng)度、寬度和直徑的單位。 ~ ；桿菌的大小(長(zhǎng)寬)為（ ~）181。m；螺旋菌的大小 (寬長(zhǎng))為（ ~ ）181。m。在進(jìn)行形態(tài)鑒定時(shí)，測(cè)其直正的長(zhǎng)度按螺旋的直徑和圈數(shù)來計(jì)算。或者說，生長(zhǎng)在固體培養(yǎng)基上、來源于一個(gè)細(xì)胞、肉眼可見的細(xì)胞群體叫做菌落或集落。菌落特征包括大小，形狀(圓形、假根狀、不規(guī)則狀等)，隆起形狀(擴(kuò)展、臺(tái)狀、低凸、凸面、乳頭狀等)邊緣情況(整齊、波狀、裂葉狀、鋸齒狀等)，表面狀態(tài)(光滑、皺褶、顆粒狀、龜裂狀、同心環(huán)狀等)，表面光澤( 閃光、金屬光澤、無光澤等)，質(zhì)地(油脂狀、膜狀、粘、脆等)，顏色，透明程度等(圖 255)。肺炎雙球菌有莢膜，菌落表面光滑粘稠，為光滑型；無莢膜的菌株，菌落表面干燥皺褶，為粗糙型；蕈狀芽孢桿菌等的細(xì)胞呈鏈狀排列，菌落表面粗糙、卷曲，菌落邊緣有毛狀突起。有的菌落有顏色，其色素有些是不溶性的，存在于細(xì)胞內(nèi)；有的是可溶性的，擴(kuò)散至培養(yǎng)基中。菌落靠得太近，由于營(yíng)養(yǎng)物有限，有害17 / 118代謝物的分泌與積累，生長(zhǎng)受到抑制。 從上可知，細(xì)菌落形態(tài)是細(xì)胞表面狀況、排列方式、代謝產(chǎn)物、好氣性和運(yùn)動(dòng)性的反映；并受培養(yǎng)條件、尤其是培養(yǎng)基成分的影響；培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短也影響菌落應(yīng)有特征的表現(xiàn)，觀察時(shí)務(wù)必注意。 如果一個(gè)菌落是由一個(gè)細(xì)菌繁殖面來，則為純培養(yǎng)。但環(huán)境條件的改變也會(huì)引起菌落性狀的改變，因此，在不同條件下，菌落特征所出現(xiàn)的微小差異不能誤認(rèn)為菌株發(fā)生了變異。前面介紹的菌落特征，主要指表面菌落。 若以穿刺法接種于半固體瓊脂試管培養(yǎng)基中，不僅可觀察群體特征，還可借以判斷該菌是否具運(yùn)動(dòng)性。此法也常用于細(xì)菌的鑒定。 在液體培養(yǎng)基中，經(jīng) 13 天培養(yǎng)，細(xì)菌生長(zhǎng)的結(jié)果，使培養(yǎng)基混濁，或在表面形成菌環(huán)、菌膜或菌醭，或產(chǎn)生絮狀沉淀(圖 260)。18 / 118圖29 常見細(xì)菌菌落的特征縱剖面：；；；；5. 臍狀；；。1877 年由合茲(Harz)首先發(fā)現(xiàn)一種寄生于牛體的厭氣性牛型放線菌，從此便引用了 Actinomyces 這個(gè)屬名，后來又發(fā)現(xiàn)了好氣性腐生的種類，也叫放線菌。我國(guó)現(xiàn)在也采用此分類系統(tǒng)。 放線菌多為腐生，少數(shù)寄生，與人類關(guān)系十分密切。這些疾病可分為兩大類，一類是放線菌病，由一些放線菌所引起，如馬鈴薯瘡痂病、動(dòng)物皮膚病、肺部感染、腦膜炎等；另一類為諾卡氏菌病，由諾卡氏菌引起的人畜疾病，如皮膚病、肺部感染、足菌病等。有的能破壞棉毛織品、紙張等，給人類造成經(jīng)濟(jì)損失。 放線菌最突出的特性之一是能產(chǎn)生大量的、種類繁多的抗生素。據(jù)估計(jì)，全世界共發(fā)現(xiàn) 4，000 多種抗生素，其中絕大多數(shù)由放線菌產(chǎn)生?？股厥侵饕幕瘜W(xué)療劑，現(xiàn)在臨床所用的抗生素種類占井岡霉素、慶豐霉素、我國(guó)用的菌肥5406也是由涇陽鏈霉菌制成；有的放線菌還用于生產(chǎn)維生素、酶制劑；此外，在甾體轉(zhuǎn)化、石油脫蠟、烴類發(fā)酵、污水處理等方面也有應(yīng)用。因此，近 30 多年來，放線菌在微生物中特別受到重視。菌絲直徑與桿狀細(xì)菌差不多，大約 1 微米。革蘭氏染色陽性反應(yīng)，極少陰性。它與結(jié)核桿菌相比，如果脫色時(shí)間太長(zhǎng)也可成為陰性，這是諾卡氏菌與結(jié)核桿菌的區(qū)別之一。根據(jù)菌絲形態(tài)和功能可分為營(yíng)養(yǎng)菌絲、氣生絲和孢子絲三種。營(yíng)養(yǎng)菌絲一般無隔膜，即使有也非常少；直徑 微米，但長(zhǎng)度差別很大，短的小于 100 微米，長(zhǎng)的可達(dá) 600 微米以上；有的無色素，有的產(chǎn)生黃、橙、紅、紫、藍(lán)、綠、褐、黑等不同色素，若是水溶性的色素，還可透入培養(yǎng)基內(nèi)，將培養(yǎng)基染上相應(yīng)的顏色，如果是非水溶性( 或脂溶性 )色素，則使菌落噸呈現(xiàn)相應(yīng)的顏色。 2. 氣生菌絲 又稱二級(jí)菌絲體。它疊生于營(yíng)養(yǎng)菌絲上，以至可覆蓋整個(gè)菌落表面。直形或彎曲而分枝，有的產(chǎn)生色素。孢子絲的形狀和在氣生菌絲上的排列方式，隨菌種而異。螺旋狀孢子絲的螺旋結(jié)構(gòu)與長(zhǎng)度均很穩(wěn)定，螺旋數(shù)目、疏密程度、旋轉(zhuǎn)方向等都是種的特征。孢子絲的排列方式，有的交替著生，有的叢生或輪生。它有一級(jí)輪生和二級(jí)輪生。21 / 118 孢子絲生長(zhǎng)到一定階段可形成孢子。孢子表面結(jié)構(gòu)也是放線菌種鑒定的重要依據(jù)。 由于孢子含有不同色素，成熟的孢子堆也表現(xiàn)出特定的顏色，而且在一定條件下比較穩(wěn)定，故也是鑒定菌種的依據(jù)之一。因?yàn)?，即使從一個(gè)孢子子絲分化出來的孢子，形狀和大小可能也有差異?，F(xiàn)以鏈霉菌為例，將放線菌生活史概括如下：孢子在適宜條件下萌發(fā)，長(zhǎng)出 13 個(gè)芽管；芽管伸長(zhǎng)，長(zhǎng)出分枝，分枝越來越多形成營(yíng)養(yǎng)菌絲體；營(yíng)養(yǎng)菌絲體發(fā)育到一定階段，向培養(yǎng)基外部空間生長(zhǎng)成為氣生菌絲體；氣生菌絲體發(fā)育到一定程度，在它的上面形成孢子絲；孢子絲以一定方式形成孢子。二、放線菌的菌落特征 放線菌的氣生菌絲較細(xì)，生長(zhǎng)緩慢，分枝的菌絲互相交錯(cuò)纏繞，因而形成的菌落小且質(zhì)地致密，表面呈緊密的絨狀或堅(jiān)實(shí)、干燥、多皺。只有放線菌中的諾卡氏菌，其菌絲體生長(zhǎng)15h~4d時(shí)，菌絲將產(chǎn)生橫隔膜，分枝的菌絲體全部斷裂成桿狀、球狀或帶杈的桿狀，這時(shí)的菌落質(zhì)地松散，易被挑取。當(dāng)產(chǎn)生的大量孢子布滿菌落表面時(shí)，就形成外觀呈絨狀、粉末狀或顆粒狀的典型放線菌菌落。若將放線菌接種于液體培養(yǎng)基內(nèi)靜置培養(yǎng)，能在瓶壁液面處形成斑狀或膜狀菌落，或沉降于瓶底而不使培養(yǎng)基混濁；如以震蕩培養(yǎng)，常形成由短的菌絲體所構(gòu)成的球狀顆粒。 放線菌長(zhǎng)到一定階段，一部分氣生菌絲形成孢子絲，孢子絲成熟便分化形成許多孢子，稱為分生孢子。凝聚分裂形成凝聚孢子。孢子成熟后，孢子絲壁破裂釋放出孢子( 圖 265)。對(duì)些種方式現(xiàn)已提出了異議。其過程是單細(xì)胞孢子絲長(zhǎng)到一定階段，首先在其中產(chǎn)生橫隔膜，然后，在橫隔膜處斷裂形成孢子，稱橫隔孢子，也中節(jié)孢子或粉孢子( 圖 266)。諾卡氏菌屬按此方式形成孢子。孢子