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2025-06-18 01:09本頁面
【正文】 氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。 影響 RNA提取的因素 RNA提取常見問題 ? RNA 的降解 ? OD260 /OD280 比值偏低 ? 電泳帶型異常 ? 下游實驗效果不佳 RNA降解 ? 新鮮細胞或組織： ? 裂解液的質量 ? 外源 RNase的污染 ? 裂解液的用量不足 ? 組織裂解不充分 ? 另外某些富含內源酶的樣品 (如脾臟 ， 胸腺等 )， 很難避免 RNA 的降解 。 RNA降解 ? 冷凍樣品： ? 樣品取材后應立即置于液氮中速凍 ， 然后可以移至70℃ 冰箱保存 。 OD260 /OD280 比值偏低 ? 蛋白質污染： ? 不要吸入中間層及有機相 ， 加入氯仿后首先混勻 ， 并且離心分層的離心力和時間要足夠 。 ? 苯酚殘留： ? 不要吸入中間層及有機相 ， 加入氯仿后首先混勻 ， 并且離心分層的離心力和時間要足夠 。 OD260 /OD280 比值偏低 ? 抽提試劑殘留： ? 確保洗滌時要徹底懸浮 RNA， 并且徹底去掉 75% 乙醇 。 ? 設備限制： ? 測定 OD260 及 OD280 數值時 ， 要使 OD260 讀數在 之間 。 ? 用水稀釋樣品： ? 測 OD 時 ， 對照及樣品稀釋液請使用 10 mM Tris， pH 。 電泳帶型異常 ? 非變性電泳： ? 上樣量超過 3ug，電壓超過 6V/cm，電泳緩沖液陳舊，均可能導致 28S 和 18S 條帶分不開。 下游實驗效果不佳 ? RNA 降解 ? 抽提試劑的殘留 75% 乙醇洗滌 ? 樣品中雜質的殘留 多糖等雜質，再次沉淀 ? DNA 污染 使用 RNaseFree 的 DNase I 消化抽提 RNA RT常見問題分析和解決方案 問題一： 少量或沒有 RTPCR產物 RNA降解 分離無污染，高質量的 RNA；防止 RNA降解 RNA中含逆轉錄酶抑制劑 70％（ v/v）乙醇清洗 RNA沉淀，除去抑制劑 起始 RNA量太低 增加 RNA的量 多糖同 RNA共沉淀 用氯化鋰沉淀 RNA以除去多糖 合成 cDNA第一鏈合成的引物退火失敗 確定退火溫度適合所用的引物 RNA模板存在較多二級結構 將 RNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性 /退火，提高逆轉錄反應溫度 反轉錄成功， PCR失敗 PCR步驟中使用超過 1/5的逆轉錄反應產物 可能原因 解決方案 問題二： 有非特異性帶 ? 引物和模板的非特異性退火 ? 基因特異性引物設計較差 ? RNA中有基因組 DNA的污染 ? 形成引物二聚體 ? 鎂離子濃度太高 提高反應的溫度和特異性 提高引物的特異性 使用擴增級 DNaseⅠ 處理 RNA 設計在 339。 如計算 DNA濃度 A260 稀釋倍數 50＝ μg/ml 紫外分光光度法只用于測定濃度大于 。 適用于低濃度核酸溶液的定量分析。高于此值表明有 RNA的殘留量。 A260/A280比值是純度檢測的重要指標。 核酸電泳 “無 RNA酶”的商品試管 ,吸頭 ,溶液和水 .通常新的無菌處理過的塑料試管和吸管無 RNA酶 (ddH2O)和溶液應該用 RNA酶的抑制劑 DEPC(焦碳酸二乙酯 )進行處理 :每 100mL溶液或水中加入 DEPC原液 ,放在搖床上充分混勻并在 37℃ 下作用數小時 .然后將溶液高壓滅菌 15min使 DEPC失活 RNA以前 ,將一些實驗室玻璃制品置于烤箱在 300 ℃ 烘烤 4h以滅活核酶 .如有可能 ,將其他設備也滅菌處理 前期準備 : 1. 在 Trizol試劑的保護下，勻漿組織，靜置裂解細胞釋放內含 RNA， Trizol試劑對 RNA有保護作用，能抑制 RNA酶的活性，并且同時有裂解細胞的作用。 ，混勻后，靜置片刻，離心，將 RNA沉淀于管底。去上清，將沉淀在真空干燥器中烘干。 各種生物大分子在一定 pH條件下．可以解離成帶電荷的離子。 人們采用各種材料作為支持 電泳介質 ．創(chuàng)造出許多新方法．其中以 瓊脂糖 和 聚丙烯酰胺 為支持介質的凝膠電泳最為突出。這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的 遷移率 。 也就是說電場強度越大電泳分子所攜帶的凈電荷數量越多，其遷移的速度也就越快。 電泳的遷移率又是同分子的摩擦系數成反比的。以及 所帶的凈電荷 的多寡。 瓊脂糖 是一種從紅色海藻產物瓊脂中提取而來的線性多糖聚合物。 瓊脂糖分子呈隨機線團狀，凝結初期由于氫鍵的作用形成雙鏈分子，而后再發(fā)生雙鏈分子間的連接直至最后固化。 根據瓊脂糖的溶解溫度， 把瓊脂糖分為一般 瓊脂糖 和 低熔點瓊脂糖 .低熔點瓊脂糖熔點為 62～
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