凝膠電泳ppt課件-在線瀏覽
2025-06-19 12:02本頁面
【正文】 蛋白質(zhì)分子量 。 垂直板電泳裝置 加樣 樣品遷移方向 電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。 混合樣品 帶孔膠 按分子大小分離 電泳方向 電泳 小分子 大分子 夾在兩塊玻璃板之間的凝膠 電泳緩沖液 電泳緩沖液 加在槽中的經(jīng)SDS處理的樣品 分子量小 分子量大 電源 電泳后的凝膠徑考馬斯亮籃染色、脫色后的凝膠照片 水平式電泳裝置 電泳緩沖液 凝膠 PAGE 的 特 點 ，分辨率高 ，用量少，靈敏度可達(dá) 106g ，分子結(jié)構(gòu)中富含酰胺基具有穩(wěn)定的親水基團 ，消除了電滲現(xiàn)象 ，有彈性，在一定濃度范圍內(nèi)無色透明 脈沖電場凝膠電泳（ PFGE） ?1984年， 。 ?在脈沖電泳中，電場方向是周期變化的，頭一個脈沖電場方向與核酸的移動方向成 45 度角，下一個脈沖的電場方向與核酸移動方向在另一側(cè)成 45 度角。 一組電極，電場方向不變，電極排列均勻， 定時改變電場方向， DNA分子的凈 DNA移動方向與電場方向相同。常規(guī)方法制備 DNA 程中，電壓有時可隨時間的增加而樣 品增加， 制備 DNA樣品與常規(guī)方法 不同 脈沖電場凝膠電泳（ PFGE） ?由于加在瓊脂糖凝膠電泳上的電場方向、電流大小、以及作用時間都在交替地變換著，這就使得DNA分子必須隨時調(diào)整其泳動的方向，來適應(yīng)凝膠孔隙的無規(guī)則變化。 PFGE can resolve large DNA fragments 類型 ? 垂直脈沖場電泳系統(tǒng) (vertical pulsed field) ? 場翻轉(zhuǎn)系統(tǒng) (field inversion) ? 旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng) (rotating gel) ? 箝位勻強電場系統(tǒng) (contourclamped homogeneous electric field)動態(tài)調(diào)控閉合均一電場電泳 A +A B +B 垂直交變電場系統(tǒng) 場翻轉(zhuǎn)系統(tǒng) 箝位勻強電場系統(tǒng) 旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng) A +A B +B A +A B +B + 影響分辨率的因素 1 脈沖時間 （ )： 增加脈沖時間分離較大分子，減少脈沖時間分離較小分子。 3 電場夾角： 電場方向的夾角常為 1100 1200，研究證實 900夾角也非常有效的。較高的溫度 DNA泳動較快；但是較高的溫度也引起較小片段的泳動截留和明顯的條帶變寬。 豎式 /聚丙烯酰胺凝膠 3) 兩種方法比較：分離效果和分離范圍 。 3. 凝膠電泳的一般程序 制膠 點樣 電泳 染色 觀察 DNA電泳 1. DNA分子種類 1) 線狀 DNA— 單鏈與雙鏈 ， ssDNA電泳時要注意局部區(qū)域形成 dsDNA， 造成遷移距離不確定 2) 環(huán)狀 DNA— 單鏈 （ 如 M13mp） 和雙鏈 （ 質(zhì)粒 DNA） 3) 線狀 dsDNA電泳 — 使用頻率最高的一種電泳 這類 DNA分子在電泳過程中遷移的距離受以下幾個因素的影響： i. 分子量 的大小 : 遷移距離與分子量的 常用對數(shù) 成反比 ii. 凝膠濃度 : 濃度越高，移動距離越短，適合分離低分子量DNA濃度越低，移動距離越長，適合分離高分子量 DNA : 低電壓時，遷移率與電壓成正比；電壓增高時，不同大小 DNA片段遷移率增大是不同的。 4) 環(huán)狀 dsDNA電泳 : 常用于質(zhì)粒 DNA的初步鑒定 5) 線狀 ssDNA電泳 鏈分離凝膠 ：化學(xué)定序時，用于單鏈分離。 核酸定序凝膠 (染料指示劑 )：為避免局部區(qū)域產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)，可采用各種變性措施，如煮沸樣品，提高電泳溫度，凝膠中加入變性劑（尿素、甲醛、甲胺等） RNA凝膠電泳 方法：不同的 RNA電泳方法是依據(jù)使 RNA分子變性所采取的方法。 1. 乙二醛 /二甲基亞砜法 原理：乙二醛可以與核酸、核苷酸及堿基發(fā)生反應(yīng)，特別是鳥苷形成一個穩(wěn)定的附加環(huán)，從而阻止 GC堿基的互補作用發(fā)生 步驟： RNA+10mM羥甲基醛和 50% DMSO混合 50℃ 、 1 h變性 點樣 電泳 染色 觀察 2. 羥甲基汞法 原理：羥甲基汞可與 RNA分子的嘌呤或嘧啶堿基發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)部位是在可形成氫鍵的亞氨基處。第二、三種方法的反應(yīng)可逆，回收RNA樣品可用于體外翻譯反應(yīng)，但操作必須小心，因兩種變性劑有毒。 差別：有無變性劑 用途：非變性凝膠可用于蛋白質(zhì)的分離純化過程中 ， 可直接用于酶促反應(yīng) （ 顏色變化 ） SDSPAGE可用于蛋白質(zhì)分子量 、 亞基組成的測定 。 核酸片段的分離與回收 — 用于 DNA、 RNA以及蛋白質(zhì)的回收 1) 電洗脫法 : 利用電泳方法將凝膠中的特定核酸分子到其它介質(zhì)中； 2) 濾紙法 — 核酸凝膠染色 長波紫外光確定位置 在分離帶前方切一口子并插入濾紙條 (其背面覆蓋透析袋膜 ) 電泳至 DNA帶全部進入濾紙條 洗脫 DNA 純化、沉淀 3) 透析袋法 — 切下含 DNA帶瓊脂塊 放入透析袋，封口 放入電泳槽 電泳 2~3小時至全部 DNA離開凝膠塊 反向電泳 1分鐘 取出 DNA液 純
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