煙草實驗操作手冊--在線瀏覽
2025-01-01 08:10本頁面
【正文】 酶的活力單位規(guī)定 1h 內(nèi) A290 增加 00l 為 PAL 的一個活力單位相當(dāng)每ml 反應(yīng)混合液形成 1μ g 肉桂酸 二．材料儀器設(shè)備及試劑 一材料 煙葉 二儀器設(shè)備 冷凍離心機分光光度計天平冰箱恒溫水浴研缽剪刀離心管洗耳球移液管具塞刻度試管 1ml 移液槍槍頭 試劑 1 0lmol 硼酸 硼砂緩沖液 pH88 2 酶提取液 01moll 硼酸 硼砂緩沖液含 1mmollEDTA 5mmol Lβ 巰基乙醇 3 002moll L苯丙氨酸溶液用 01molL pH88 硼酸緩沖液配制 4 6moll HCl 5 100μ gml 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液準(zhǔn)確稱取 10 mg 牛血清白蛋白于燒杯內(nèi)用蒸餾水溶解完全轉(zhuǎn)移到 100ml 容量瓶內(nèi)定容至刻度混勻 6 考馬斯亮藍 G250 蛋白質(zhì)染色液稱取 10mg 考馬斯亮藍 G250 溶于 5ml95乙醇中加入 85％ WV 磷酸 l0 ml 混勻后即為母液利用時按 15ml 母液加 85m1 蒸餾水的比例稀釋混勻后過濾即為稀釋液 三操作步驟 1 酶液提取植物材料 lg 剪成小段加入 5 倍體積的酶提取液于冰浴上研缽研磨 2 將已勻漿的酶液用三層紗布過濾濾液轉(zhuǎn)入離心管 10000g 冷凍離心 30min 3 離心后取上清液即為酶粗提液量出其體積放置冰浴中備用 4 酶活力測定 取試管 3 支按表中所述加樣 0 號為調(diào)零管 1 號為測定管 2 號為對照管 試管編號 1 2 3 01moll 硼酸緩沖液 4 39 49 酶液 01 01 002moll 苯丙氨酸 ml 1 1 將各管混勻放入 40℃恒溫水浴保溫 1h 到時加 02ml 6mol1HCl 終止反應(yīng) 紫外分光光度計預(yù)熱 l0 min 于波長 290nm 處測定各管的 A290 5 考馬斯亮藍染色法測定蛋白質(zhì)濃度 取酶液 01ml 用蒸餾水稀釋至 5ml 取試管 8 支按下表加入各溶液 試管編號 0 1 2 3 4 5 6 7 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液 ml 0 02 04 06 08 10 稀釋酶液 mI 1 1 蒸餾水 ml 2 18 16 14 12 1 考馬斯亮藍 ml 2 2 2 2 2 2 2 2 將上述各管混勻靜置 2min 測定各管的 A595 四結(jié)果處理 1 PAL 活 力的公式為 植物樣品中 PAL 活力 式中 A290 為 290nm 的吸光值 Vt 為提取液總體積 mL W 為樣品鮮重 g VS 為測定時加樣量 mL 2 蛋白質(zhì)含量的公式為 mgg 式中 C 為查標(biāo)準(zhǔn)曲線值μ g VT 為提取液總體積 mL WF 為樣品鮮重 g VS 為測定時加樣量 mL 注意繪制蛋白質(zhì)測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線以 15號管溶液的 A595值為縱坐標(biāo)相應(yīng)管中的蛋自質(zhì)微克數(shù)為橫坐標(biāo)作圖 有機成分的測定流程 31 總氮的測定王艷麗 干重 0105g 依樣品含氮量而定含氮 13mg 為宜 用凱氏定氮儀測定 煙堿的測定 鹽酸萃取法 孔霖 一實驗原理 煙堿在強酸條件下可從煙葉中脫離出來同時色素進入提取液利用活性炭的吸附作用脫色煙堿對特定波長的光有吸收能力測定煙堿的含量 二測定步驟 1．待測液的制備 稱取 0030 g 樣品放入 100ml 的三角瓶加 13 角匙的活性炭和 25ml 05N 的鹽酸振蕩 5 min 過濾到 100 ml 的容量瓶中洗三角瓶合并濾液并定容搖勻待測 2 空白 取 05N 25ml 鹽酸加入容量瓶中定容搖勻 3 測定 以空白參比在分光光度計儀器上調(diào)讀數(shù)為零在 3 個波長處236nm259nm282nm 分別測定 A 4 計算 煙堿 1059 ｛ A259－ 05A236A282｝ 100 100W 1－水 343 1000 式中 1059 是校正系數(shù) F 是稀釋倍數(shù) V 是待測試液體積 343 是煙堿的吸光系數(shù) 33 游離氨基酸的測定茚三酮顯色法潘舒 一原理 氨基酸的氨基可與水合茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生藍紫色化合物其吸收峰在 570nm 顏色的深淺與游離氨基酸的含量成正比 二儀器設(shè)備及試劑配制 一儀器設(shè)備 分光光度計分析天平研缽燒杯容量瓶試管移液管水浴鍋三角瓶漏斗 試劑配制 水合茚三酮試劑 取 06g 再結(jié)晶的茚三酮加入 15ml 正丙醇攪拌溶解再加 30 ml 正丁醇和 60ml 乙 二醇最后加入 9 ml pH54 的乙酸 乙酸鈉緩沖液混勻貯于棕色瓶 4℃保存?zhèn)溆?10d 內(nèi)有效 乙酸 乙酸鈉緩沖液 pH54 稱乙酸鈉 544g 加入 100ml 超純水加熱至沸使體積蒸發(fā)至 60 ml 左右冷卻轉(zhuǎn)入 100 ml 容量瓶加入 30 ml 冰醋酸超純水定容至 100 ml 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸 5 μ gml 標(biāo)曲用稱 80℃烘干的亮氨酸 468mg 溶于少量 10 異丙醇中用 10 異丙醇定容 100ml 取 5ml 蒸餾水稀釋至 50ml 01 抗壞血酸取 50mg 抗壞血酸溶于 50ml 超純水中現(xiàn)配現(xiàn)用 實驗步驟 一標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取 6 支 20ml 刻度試管按下表加 入試劑混合均勻 沸水中加熱 20min 取出后用冷水迅速冷卻并不時搖動使加熱時形成的紅色被空氣逐漸氧化而褪去進而呈現(xiàn)藍紫色時用 80 乙醇定容至 20ml 混勻后用 1cm光徑比色皿在 570nm下比色測定吸光度以氨基酸濃度為橫坐標(biāo)以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 管號 1 2 3 4 5 6 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸 ml 00 02 04 06 08 10 蒸餾水 ml 20 18 16 14 12 10 水合茚三酮 ml 30 30 30 30 30 30 抗壞血酸 ml 01 01 01 01 01 01 每管含氮量μ g 00 10 20 30 40 50 二樣品測定 取鮮樣 05g 洗凈擦干并剪碎沸水浴 10min 取 1ml 待測液放入 20ml 干燥試管中加入 1ml 超純水 依次加入 3ml 水合茚三酮試劑 01ml 01 抗壞血酸現(xiàn)配先用 沸水浴顯色 20min冷卻后加入 80乙醇并定容至 20mL混勻后用 1cm光徑比色皿在 570nm 下比色測定吸光度 四．結(jié)果計算 100 式中 C 為查標(biāo)準(zhǔn)曲線值得氨基態(tài)氮含量μ g
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