【正文】 分鐘；6． 棄去上清， CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；7． 4℃下3000 g冷凍離心5分鐘；8． 棄去上清， CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸?。?． 細(xì)胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)或添加冷凍保護(hù)劑（15% 20%甘油）后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǎ?0℃）。以下步驟務(wù)必在超凈工作臺(tái)和冰上操作4. ，在冰上冷卻10分鐘；5. 4℃下3000g冷凍離心5分鐘；6. 棄去上清，加入1500ml冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸??；7. 4℃下3000g冷凍離心5分鐘8. 棄去上清，加入750ml冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸??；9. 4℃下3000g冷凍離心5分鐘10. 加入20ml冰冷10%的甘油，用移液器輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸浮；11. 立即使用或迅速置于70186。附注：影響感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的因素及實(shí)際操作過(guò)程中應(yīng)注意的事項(xiàng)：1) 細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)：實(shí)驗(yàn)中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度，盡量使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（一般通過(guò)檢測(cè)OD600來(lái)控制。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率；6) 質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響：用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的DNA；7) 一定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度呈正比；實(shí)驗(yàn)五 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的鑒定質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)粒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程?？梢圆捎枚喾N方法篩選和鑒定目的克隆。實(shí)驗(yàn)材料：外源片段與載體的連接產(chǎn)物；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。在被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，重組子基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上可挑選所需的轉(zhuǎn)化子。同時(shí)DNA在電場(chǎng)中形成的極性對(duì)于它運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞也是非常重要的。C培養(yǎng)1小時(shí)；8． 吸取合適體積的菌液涂布已倒好的選擇培養(yǎng)基平板；9． 37186。附注：1． 利用氨芐青霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子時(shí)，用轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪平板的密度要低（90mm平板上不得超過(guò)105個(gè)菌落），同時(shí)37℃培養(yǎng)不應(yīng)超過(guò)20小時(shí)，具氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化體可將b－內(nèi)酰胺酶分泌到培養(yǎng)基中，迅速滅活菌落周圍的抗生素，從而導(dǎo)致對(duì)氨芐青霉素敏感的衛(wèi)星菌落的出現(xiàn)。4) 小量提取質(zhì)粒酶切檢測(cè)、PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)六 PCR技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）是一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，是分子克隆技術(shù)中的常用技術(shù)之一。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆誔CR原理，學(xué)習(xí)PCR操作過(guò)程實(shí)驗(yàn)材料：轉(zhuǎn)基因水稻葉片總DNA，外源基因的特異引物實(shí)驗(yàn)原理：PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。反應(yīng)分為變性、退火、延伸三步，經(jīng)過(guò)一定的循環(huán)，介于兩個(gè)引物之間的特異DNA片段得到大量擴(kuò)增。 buffer mlMgCl2（25mM） mlPrimer F (10181。M) mldNTPs（2mM） mlTaq（5U/ml） mlAdd ddH2O to 20 ml3．PCR反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置：95℃ 339。 55℃ 139。30 35 cycles72℃ 839。附注：1． 引物設(shè)計(jì)應(yīng)具有特異性，依靠引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；引物分裝成多管，不宜反復(fù)凍融多次；2． PCR反應(yīng)的各種成份不能遺漏，操作應(yīng)戴手套，冰上操作；3． 根據(jù)引物的Tm值和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度以及PCR儀的特性來(lái)設(shè)定PCR循環(huán)條件；4． 注意分析電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物時(shí)出現(xiàn)拖帶或非特異性擴(kuò)增帶、無(wú)DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。DNA轉(zhuǎn)移至固相支持物的過(guò)程中各DNA的相對(duì)位置保持不變，用一定方法（如放射性同位素）標(biāo)記的DNA探針與固著在膜上的DNA 雜交，經(jīng)X光片自顯影顯現(xiàn)出與探針DNA互補(bǔ)的DNA電泳條帶的位置。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?了解植物DNA抽提的主要方法，掌握CTAB法快速抽提水稻DNA。 CTAB是一種非離子去污劑，植物材料在CTAB的處理下，結(jié)合65176。CTAB與核酸形成復(fù)合物，此復(fù)合物在高鹽（）濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度（ NaCl）下CTAB核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。再經(jīng)過(guò)氯仿/異戊醇(24:1) 抽提去除蛋白質(zhì)、多糖、色素等來(lái)純化DNA，最后經(jīng)異丙醇或乙醇等DNA沉淀劑將DNA沉淀分離出來(lái)。2. CTAB到95℃，加1ml到裝有葉片粉末的離心管中，混勻（防止凍融）。4. 12000g離心5分鐘。l，加入等體積（600181。6. 12000g離心5分鐘。l 10M NH4AC），混勻，室溫放置10min。9. 加入50181。g/RNase），置于4℃過(guò)夜，待DNA溶解后，檢測(cè)DNA濃度及質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)原理：參見(jiàn)系列一中實(shí)驗(yàn)二；限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)：見(jiàn)“基因操作原理”。l % 凝膠檢測(cè)；2．將DNA調(diào)節(jié)濃度至300400 ng/181。l）廠家配套試劑；3．計(jì)算據(jù)反應(yīng)條件所需要的各種試劑準(zhǔn)確用量：（ ml tube中）DNA(35181。l10180。l) （冰上）ddH2O 混勻，短暫離心；4．37℃ 溫浴12 hrs (純DNA) 或10 hrs（粗制DNA）；5．加入上樣緩沖液終止酶切反應(yīng)，也可65℃加熱10 min使酶變性失活；6．電泳檢測(cè)酶切效率：每個(gè)樣品取1/10量用瓊脂糖電泳檢測(cè)，制膠及點(diǎn)樣方法同上。思考：什么是酶星活性？如何避免？影響酶切效率的因素？EB指示劑原理？實(shí)驗(yàn)三 電泳、轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜是把DNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物（一般是尼龍膜）上固定，是進(jìn)行各種后續(xù)研究（如RFLP分析，陽(yáng)性克隆的篩選驗(yàn)證等所有涉及分子雜交的研究）的前提。尼龍膜兩邊均有同樣吸附DNA功能，無(wú)論用哪邊均可以經(jīng)久耐用，可反復(fù)利用10次以上（1020次），經(jīng)毛細(xì)管（毛細(xì)吸附）作用，把DNA從凝膠上轉(zhuǎn)到膜上。 3. 轉(zhuǎn)移緩沖液（transfer buffer）的選擇：帶正電荷的尼龍膜：可用高鹽離子強(qiáng)度（SSC），但不能充分發(fā)揮膜潛能； NaOH，共價(jià)結(jié)合DNA是最大優(yōu)點(diǎn)。4．轉(zhuǎn)膜時(shí)間（duration of transfer）約12 hrs取決于毛細(xì)管系統(tǒng)，DNA大小，膠厚度(5 mm)及濃度(1%)。DNA轉(zhuǎn)移的效率較難判斷，只有在轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，通過(guò)EB染膠，及分子雜交才可以鑒別效率高低，但已無(wú)補(bǔ)救措施，因此，每一步應(yīng)嚴(yán)格操作。一般大電泳槽配制250ml %瓊脂糖凝膠，采用42孔梳子（經(jīng)濟(jì)，高效）制樣，點(diǎn)樣：DNA樣品中指示劑量稍多電泳：， 使DNA遷移到適當(dāng)距離，一般指示劑約移動(dòng)1011cm (大電泳槽：40V1215hrs，小電泳槽30V45 hrs)2．轉(zhuǎn)膜前的準(zhǔn)備：依膠大小每塊凝膠準(zhǔn)備兩張比膠稍大的濾紙（11 cm），兩張用作鹽橋的濾紙，一張與膠同樣大小的尼龍膜（10），兩個(gè)玻璃盤、兩塊有機(jī)玻璃板、一根玻璃棒，比尼龍膜稍大的一疊吸水紙等。4．凝膠的預(yù)處理:a) 從電泳槽中移出凝膠置于塑料板上，用切膠板把膠切成適當(dāng)大小，切去右上角（最后一個(gè)樣品的最前端）作為電泳方向記號(hào)b) 把凝膠翻面， HCl玻璃盤中，輕輕搖動(dòng)10min，使指示劑變黃色為止（脫嘌呤）c) 倒去HCl溶液，加蒸餾水漂洗凝膠d) 倒去蒸餾水， NaOH中和e) NaOH，立即將膠放在鹽橋上（忌氣泡）5．膠的四周用塑料片與膠緊緊相連，防止短路（吸水紙與鹽橋相接）6． NaOH，小心放置膜（ NaOH）使膜覆蓋整塊膠（要求一次成功，不能移動(dòng)）7．膜上放2張濾紙，濾紙大小為1512cm8．放不少于5cm厚的吸水紙，放上玻板，其上壓約500g的重物，轉(zhuǎn)膜12 hrs左右 9．轉(zhuǎn)膜完畢，用2SSC漂洗膜兩次，各五分鐘。10．用兩張濾紙包住膜，置于80100℃的真空干燥箱中，干燥24 hrs。另外如果需要鑒定或?qū)ふ遗c已知DNA同源的DNA片段如：染色體步查、基因組文庫(kù)的評(píng)價(jià)和利用、陽(yáng)性克隆的分析鑒定、轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)分析等也都需進(jìn)行DNA的分子雜交實(shí)驗(yàn)。1．預(yù)雜交：膜上有許多沒(méi)有結(jié)合DNA分子的地方，若不在雜交前用一些封閉劑結(jié)合位點(diǎn)，加入探針后，探針DNA分子將會(huì)結(jié)合在這些位點(diǎn)上，導(dǎo)致雜交背景深，預(yù)雜交的目的是用非特異性DNA分子（鮭精DNA）及其它高分子化合物（封閉劑）將待雜交膜中的非特異性位點(diǎn)封閉，從而減少雜交背景。這些方法有的是在特定位置標(biāo)記核酸（5’或3’末端），有的標(biāo)記核酸分子內(nèi)部的多個(gè)位點(diǎn)。有的方法產(chǎn)生一定長(zhǎng)度的標(biāo)記產(chǎn)物，有的得到的是長(zhǎng)短不一的標(biāo)記產(chǎn)物。如果寡核苷酸序列是不同的（heterogeneous），引物中包含所有可能的隨機(jī)序列（如6堿基引物則有46=4096種），可以與任意模板序列相配對(duì)在許多位置形成雜交鏈，四種核苷酸底物中有一種是用同位素標(biāo)記的，因而可產(chǎn)生均勻一致高比活放射性探針。同位素標(biāo)記的探針DNA的平均長(zhǎng)度與引物的濃度成反比 [=k/(lnPc)1/2， Pc是引物的濃度]，一般可產(chǎn)生約400600 bp的標(biāo)記產(chǎn)物。環(huán)狀DNA用限制性內(nèi)切酶切成線狀，再標(biāo)記。dNTPs： 其中一種用放射性同位素標(biāo)記3．雜交： 將標(biāo)記好的探針，加到雜交液中，在一定（溫度下）條件下，使探針與膜上的DNA雜交。2. 標(biāo)記探針：反應(yīng)體系：12blots()DNA 100ngDNTP Random primer Klenow (1u/181。la dCTP* add ddH2O to 按先將水和DNA ，混勻，短暫離心至管底，放至100℃干浴中變性10 min，變性探針迅速置于冰浴上5 min，按反應(yīng)體系將反應(yīng)混合液（dNTP，Random primer，Klenow ）加入變性DNA中，在同位素操作臺(tái)上，加入32P標(biāo)記的dNTP（a32P dCTP*，放射性比活3000Ci/mmol），30℃溫育3小時(shí)以上。l雜交液，100℃變性（or NaOH變性），加入雜交袋（盒）中（忌直接加于膜上）。雜交效率受雜交速率及雜交穩(wěn)定性影響。檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度 174。SSC/%SDS or SSC/%SDS。自來(lái)水沖洗干凈后，晾干，讀片。附注：1. 雜交效率的影響因素a) 雜交溫度：雙鏈DNA分子，T=Tm20—25℃可達(dá)最大雜交率，DNARNA雜交分子則低于Tm 值1015℃。2. 影響雜交穩(wěn)定性（影響解鏈溫度的）因素a) 離子強(qiáng)度 NaCl之間, 每173?！鎎) 堿基組成 ATCG（在NaCl溶液中）；c) 去穩(wěn)定劑（destabilizer） DNADNA雜交分子，每1%formamide,Tm175。對(duì)于單鏈探針，可以增加10fold雜交信號(hào)，dsDNA成100fold地增加雜交信號(hào)4) 提高特異性：a) 高鹽溶液促進(jìn)探針與靶序列的堿基配對(duì)20SSC 3M NaCl/ Na3Cib) 雜交后洗膜溫度T174。4．放射性同位素：1) 放射性同位素發(fā)出的射線主要有：a粒子：外照射，一般能量的α粒子穿透能力較弱，射程短，危害性小，稍加防護(hù)即可（如手套）；內(nèi)照射，電離密度大，危害大。g射線：穿透能力很強(qiáng)，外照射時(shí)危害性很大，應(yīng)采取切實(shí)有效的防護(hù)措施。即A=dN/dt放射性活度的單位是Becquerel(貝克勒而)，簡(jiǎn)稱Bq。3) 輻射防護(hù)的目的:防止發(fā)生對(duì)健康有害的確定性效應(yīng)(接受放射性治療的患者除外), 并將隨機(jī)性損害效應(yīng)的發(fā)生降低到被認(rèn)為可以接受的水平，從而保障放射工作人員、公眾及其后代的健康與安全，提高放射防護(hù)措施的效益，促進(jìn)放射工作的發(fā)展。c) 個(gè)人劑量限制：為了保證每個(gè)人不致受到不合理的危害，必須制定一個(gè)個(gè)人劑量限制值，放射工作人員的劑量限制：全身均勻照射的年當(dāng)量劑量限值H全身=50mSV。5) 外照射的防護(hù)措施：a) 距離防護(hù)：人體受到照射的劑量率隨著離開(kāi)電離輻射源的距離的增大而減少。b) 時(shí)間防護(hù)：在劑量率不變時(shí)，劑量與時(shí)間成正比，即操作時(shí)間越短，人員所受到的照射劑量越小。）c) 屏蔽防護(hù)：利用射線通過(guò)物質(zhì)時(shí)，與物質(zhì)相互作用使其能量被物質(zhì)吸收而逐漸減弱的原理，可以設(shè)置一定的屏障物來(lái)進(jìn)行防護(hù)。d) 利用衰變：可利用放射性物質(zhì)存在自發(fā)衰變，其活性隨之減少的原理進(jìn)行外照射防護(hù)。6) 內(nèi)照射的防護(hù)措施防止放射性物質(zhì)經(jīng)呼吸道吸入防止放射性物質(zhì)食入防止放射性物質(zhì)經(jīng)體表進(jìn)入系列三 表達(dá)檢測(cè)在轉(zhuǎn)錄水平上研究和了解基因的表達(dá)與調(diào)控是分子生物學(xué)和基因操作的重要內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)一 RNA Extraction (mini prep)RNA的制備與分析對(duì)于了解基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)與調(diào)控和cDNA的合成都是必須的，RNA的純度和完整性對(duì)于Northern blot，RTPCR和cDNA文庫(kù)的構(gòu)建等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)都至關(guān)重要。4 M LiCl可選擇性沉淀RNA。C until use.2. Grind leaf discs using a steel bar (precooled in liquid nitrogen) that perfectly fits the eppendorf tube. Keep the plant material frozen allows easy grinding to a fine powder.3. After grinding , add 500ml of hot extraction buffer (80℃) and phenol (1:1 ) (250 ml of each). (Extraction buffer: M LiCl, 100 mM pH=, 10 mM EDTA, 1% SDS)4. Homogenized the mixtures by vortex for 30 seconds, and add 250 ml chloroform/isoamyl