質(zhì)粒提取有關(guān)問題及注意點(diǎn)-在線瀏覽
2025-05-13 04:08本頁(yè)面
【正文】 般的發(fā)放。加入溶液II后，菌液仍然呈渾濁狀態(tài)，或者混濁度沒有明顯的改變？裂解不完全,參考見解：?jiǎn)栴}可能是發(fā)生在溶液II上。可能是“雜菌”污染，如果菌液生長(zhǎng)異常快，就有可能被雜菌污染。抽提DNA去除蛋白質(zhì)時(shí)，為什么要是酚/氯仿混合使用？怎樣使用酚與氯仿較好？參考見解：酚與氯仿都是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。也可以在第二次抽提時(shí)，將酚與氯仿混合（1:1）使用。為了防止酚的氧化，％。用Tris ，最好分裝在棕色小試劑瓶里，上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，以裝滿蓋緊蓋子為宜，如有可能，可充氮?dú)夥乐古c空氣接觸而被氧化。為什么用酚與氯仿抽提DNA時(shí)，還要加少量的異戊醇？參考見解：在抽提DNA時(shí)，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時(shí)在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)阻止相互間的充分作用。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。加入酚/仿抽提，離心后在水相和有機(jī)相間沒有出現(xiàn)變性蛋白相層，在隨后的乙醇沉淀步驟中卻出現(xiàn)大量的半透明沉淀，溶解后發(fā)現(xiàn)蛋白濃度很高？乙醇沉淀時(shí)，較純的質(zhì)粒沉淀是白色的（PEG純化的沉淀是透明的肉眼不易發(fā)現(xiàn)），如沉淀是半透明的凝膠狀，則應(yīng)是蛋白含量高。使用酚仿抽提方法，質(zhì)粒的純度很好，但酶切不能完全切開?參考見解：確認(rèn)酶的有效性。是否不小心吸入了痕量的酚。乙醇漂洗后是否完全干燥（殘留的乙醇會(huì)影響酶切）。如果你不小心在溶液II加入后過度振蕩，會(huì)有第四條帶，這條帶泳動(dòng)得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是20100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。參考見解：更換RNase A，并保證其儲(chǔ)存條件是正確的手工提取質(zhì)粒的，可單獨(dú)增加一步去除RNA的步驟，溶液III反應(yīng)后，在離心的上清中加RNase，室溫下去除RNA 10min～30min（需要保證RNase A是經(jīng)過失活DNase的），同時(shí)較高溫度（如50℃）會(huì)更加快速完全的去除RNA，經(jīng)驗(yàn)所得經(jīng)過高溫處理的質(zhì)粒質(zhì)量不是很高。當(dāng)電壓太大時(shí)，容易出現(xiàn)火箭狀，而降解應(yīng)該是彌散狀。轉(zhuǎn)化到其它宿主菌再切。用堿裂解法提取質(zhì)粒，裂解5分鐘，沒有用酚 / 氯仿抽提，最后用滅菌水溶解質(zhì)粒DNA15min。在溶解的過程要渦旋處理促進(jìn)溶解。也可能在用乙醇洗時(shí)把質(zhì)粒倒掉了。用堿裂解法提取的質(zhì)粒,取3ul轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌涂amp抗性平板，卻出現(xiàn)陽(yáng)性克隆較少（含綠色熒光蛋白，陽(yáng)性克隆應(yīng)該顯綠色，在紫外燈下非常明顯，就幾十個(gè)菌落）大部分菌落不發(fā)綠，這些菌落比發(fā)綠的菌落小一些的現(xiàn)象，為什么？參考見解：做一次陰性對(duì)照,拿空白菌涂布在含amp的平板上,如生長(zhǎng),說明amp過期,一般這種情況不多見。拿陰性和陽(yáng)性的細(xì)菌各取數(shù)個(gè)放于高濃度的amp液體培養(yǎng)基中,如能生長(zhǎng),說明空白菌中帶有耐藥菌,建議換菌.提質(zhì)粒的菌受污染了，重新劃線挑單克隆。主要是培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致培養(yǎng)基中的beta內(nèi)酰胺酶過多，作用時(shí)間過長(zhǎng)，同時(shí)培養(yǎng)基pH值降低，氨芐青霉素失活，從而使無(wú)質(zhì)粒的菌株大量增殖。|||謝謝樓主,還有什么專題也要貼出來啊!|||謝謝分享到一個(gè)小tips。大蝦憑手感就可以了,我們還是要學(xué)學(xué)的,受益匪淺1．溶液I—溶菌液：溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。但當(dāng)pH＞12或pH＜3時(shí)，就會(huì)引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。SDS：SDS是離子型表面活性劑。（2）解聚細(xì)胞中的核蛋白。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時(shí)）受到干擾。所以該溶液實(shí)際上是NaAcHAc的緩沖液。而高鹽的3mol／L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。4．為什么用無(wú)水乙醇沉淀DNA？用無(wú)水乙醇沉淀DNA，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。因而也可改用95％乙醇來替代無(wú)水乙醇（因?yàn)闊o(wú)水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95％乙醇昂貴）。折中的做法是初次沉淀DNA時(shí)可用95％乙醇代替無(wú)水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無(wú)水乙醇。5．在用乙醇沉淀DNA時(shí)，～？在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時(shí)，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時(shí)，其效果也不好。6．加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS與KAc來處理？加進(jìn)去的RNase本身是一種蛋白質(zhì)，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS蛋白復(fù)合物沉淀，再加KAc使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物，使沉淀更加完全。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa＝）和硼酸系統(tǒng)（pKa=）等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2＋產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反應(yīng)時(shí)，不同的酶對(duì)輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用TrisHCl（pKa=）的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時(shí)，大都采用TrisHCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。％ PEG，其最終PEG濃度為12％。9．抽提DNA去除蛋白質(zhì)時(shí)，怎樣使用酚與氯仿較好？酞與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。也可以在第二次抽提時(shí)，將酚與氯仿混合（1:1）使用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。用Tris調(diào)節(jié)至pH為8是因?yàn)镈NA在此條件下比較穩(wěn)定。保存在冰箱中的酚，容易被空氣氧化而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以便用。8羥基喹琳是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。平時(shí)保存在4℃或－20℃冰箱中，使用時(shí)，打開蓋子吸取后迅速
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