rna提取準(zhǔn)備工作及注意事項-在線瀏覽
2025-06-30 22:36本頁面
【正文】 離開活體/或者原來的生長環(huán)境后，樣品中的內(nèi)源酶即會開始降解 RNA，降解速度與內(nèi)源酶含量及溫度有關(guān)。這兩個辦法都要求操作快速。具體地講，植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等最好都先用液氮冷凍起來，再往下做。細(xì)胞無須破碎即可直接勻漿，組織需要破碎后才能勻漿，酵母菌和細(xì)菌需要先用相應(yīng)的酶破壁后才能勻漿。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的勻漿方法是使用電動勻漿器。裂解液的選擇 – 影響操作方便程度，內(nèi)源雜質(zhì)殘留的因素常用的裂解液幾乎都能抑制 Rnase 活性，因此，選擇裂解液的重點是要結(jié)合純化方法一起考慮。純化方法的選擇 – 影響內(nèi)源雜質(zhì)殘留，抽提速度的因素對于干凈的樣品，如細(xì)胞，手邊的幾乎任何純化方法都可以獲得滿意的結(jié)果。柱離心式純化方法抽提速度快，能有效去除影響 RNA 后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，但價格較貴；使用經(jīng)濟而經(jīng)典的純化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以獲得滿意的結(jié)果，但操作時間長。注意一：嚴(yán)格戴好口罩，手套。注意三：實驗所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保 RNaseFree。注意五：選擇合適的裂解液。紀(jì)律三：明確自己的抽提目的注意七：任何裂解液系統(tǒng)在接近樣品最大起始量時，抽提成功率急劇下降。RNase 污染的10大來源1）手指頭，手指頭是外源酶的第一來源，所以必需戴手套并且頻繁更換。戴手套口罩的另外的好處是保護實驗人員。移液器最好是專用的，用前用 75% 的酒精棉球搽拭干凈，尤其是桿子；另外，一定不要使用褪頭器。4）實驗臺面最起碼要用 75% 的酒精棉球搽拭干凈。液氮保存/碾磨方法的確不方便，但對有一些內(nèi)源酶含量很高的組織，卻是唯一的辦法。7）質(zhì)粒抽提質(zhì)粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA，殘留的 Rnase 要用 Proteinase K 消化，PCI 抽提。長期保存 RNA 的最好辦法是鹽/醇懸液，因為醇在低溫時抑制所有的酶活性。10）后續(xù)實驗所用的酶酶均有可能被 Rnase 污染。2：選擇合適的抽提方法高核酶含量的組織，脂肪組織最好用含苯酚的方法。RTPCR 對純度 （酶抑制物殘留） 要求很高。5：檢查 RNA 的完整性電泳檢測，28S：18S =2：1 是完整的標(biāo)志，1：1 對大部分實驗也是可以接受的。7：降低外源酶的污染 – 不能從外面又導(dǎo)入酶。但要防止助沉淀劑含酶及 DNA 污染。10：合適的保存方法 – 短時間可以 –20C 保存，長期請保存于 –80C。高豐度 （24ug/mg） 的如肝臟，胰腺，心臟，中豐度 （） 的如腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢，低豐度 （） 的如膀胱，骨，脂肪。電動勻漿比其它勻漿方法效果更好，但也可能需要結(jié)合其它得方法，如液氮搗碎，酶消化 （Lysozyme/Lyticase）2：抽提方法的優(yōu)化。分層不徹底是因為核酸和蛋白質(zhì)含量高，可以用增加裂解液使用量或者降低樣品量解決。RNA 的丟失可以用反抽方法或者去除有機層后再離心的方法降低。經(jīng)典抽提小技巧1）Ph
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