【正文】 程 10 實驗過程 10 溶菌酶的提取 10 鹽折 11 溶菌酶的的鑒定 11 溶菌酶酶性的測定 13第3章 結(jié)果與討論 15 pH值的影響 15 pH值對抽提的影響 15 pH值對酶活的影響 16 溫度的影響 16 16 17 NaCl濃度的影響 18 18 不同的NaCl濃度對酶活的影響 19 鹽析時pH值對溶菌酶活性的影響 19 溶菌酶酶活性 20 溶菌酶抑菌效果 20 溶菌酶活力測定 20結(jié) 論 22參考文獻(xiàn) 23致 謝 2521第1章 緒 論第1章 緒 論在自然界中，溶菌酶廣泛地存在于動植物體內(nèi)和人的外分泌液中。雞蛋清中的溶菌酶是目前從動植物中分離最多的溶菌酶之一。 ~，分子量約14000道爾頓。（1）在醫(yī)學(xué)上，它是一種高效抑菌、殺菌、抗病毒蛋白質(zhì)，它能夠分解殺滅諸如葡萄球菌屬、鏈球菌屬等革蘭氏陽性菌，用于抗菌、抗病毒、止血、消炎等。所以它具有抗炎功效，并以保護(hù)機(jī)體不受感染，它能分解稠厚的粘蛋白使其變稀薄，使膿性創(chuàng)口滲出物液化而易于排出；能清除壞死粘膜，加速粘膜組織的修復(fù)和再生；和抗生索具有很好的協(xié)同增效作用．用溶菌酶制成的漱口液還可預(yù)防齲齒[1]。氯化溶菌酶醫(yī)療效果更廣，有濃疲分散、出血抑制、組織修復(fù)、消炎鎮(zhèn)痛、抗過濾性病毒等作用，因而用氯化溶菌酶的制藥有消炎消痔、治感冒、皮膚病及眼、鼻、喉等用藥。目前日本已有含溶菌酶的牙膏生產(chǎn)[2]。溶菌酶作為防腐劑有以下優(yōu)點(diǎn)：(a)溶菌酶是很穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，有較強(qiáng)的抗熱性。溶菌酶是一種天然蛋白質(zhì)，1992年FAO\WTO的食品添加劑協(xié)會已經(jīng)認(rèn)定溶菌酶在食品中應(yīng)用是安全的[3]。新鮮蔬菜、水果、魚肉等均可用涂溶菌酶溶液來防腐。魚糕、糕點(diǎn)、酒類、新鮮水產(chǎn)品等也可用溶菌酶來防腐。一般應(yīng)用溶菌酶進(jìn)行菌體或細(xì)胞破壁提取細(xì)胞內(nèi)容物（如原生質(zhì)體等）應(yīng)用于融合育種，或生產(chǎn)蛋白質(zhì)、核酸 類呈味物質(zhì)。（4）在發(fā)酵工業(yè)中，該酶作為一種重要的溶菌劑可用于無菌體提取液的制取等。利用海工程在環(huán)境工程中是一個很有前途的發(fā)展方向，溶菌酶以其特有的性質(zhì)在環(huán)境工程中的應(yīng)用更具潛力。 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢最早有關(guān)溶菌酶的報道的是1907年NicoHe首次發(fā)表桔草芽胞桿菌(Bacillus．subtitis)溶解因子存在；1909年拉希琴科指出，雞蛋清具有強(qiáng)抑菌作用。1927年，英國菲利普集團(tuán)發(fā)表了對雞蛋清溶菌酶一作用底物復(fù)合體第一射線衍射的研究[5]。1967年，英國菲利普集團(tuán)首先發(fā)表了關(guān)于對雞卵白溶菌酶作用底物復(fù)合體X射線衍射，具體地介紹了其結(jié)構(gòu)，這項研究成果在近代酶化學(xué)史上有著舉足輕重的地位。麥耶等人于1936年最先發(fā)表了溶菌酶精制的報告，豎年，亞伯拉罕等人用大致相 同的方法獲得了溶菌酶結(jié)晶標(biāo)準(zhǔn)品。自20世紀(jì)50年代以后，隨著實驗工具的飛速發(fā)展， 對雞蛋清溶菌酶和許多動物溶菌酶的研究也更加確切，例如對溶菌酶的結(jié)構(gòu)、氨基酸排列等有了更淸楚的了解。LiChan (1986)用陽離子交換柱色譜分離蛋淸中溶菌酶，他用DuoliteC464 (一種弱酸性陽離子交換樹脂）吸附溶菌酶，再用一定濃度和pH的氯化鈉溶液或磷酸鹽緩沖液將溶菌酶洗脫下來，得到活力較高的溶菌酶，收率高達(dá)90%~95%。Chiang (1993)結(jié)合超濾和親和色譜分離純化蛋淸溶菌酶，二次超濾濃縮后再用幾丁質(zhì)純化，得到髙活力溶菌酶，酶收率高達(dá)80%，但是成本較高。也可采用大孔苯乙烯系強(qiáng)堿陰離子吸附型交換樹脂從蛋淸中提取溶菌酶（成均勻，1991）。蔣冶良（1997)利用超濾技術(shù)制備溶菌酶，冷凍干燥得到的溶菌酶質(zhì)量達(dá)到藥用標(biāo)準(zhǔn)（活力4000U/mg)。Shuting chon (1998)用反膠束萃取雞蛋淸溶菌酶，收率90%，比活高達(dá) 73000U/mg，是目前有報道的資料中溶菌酶活力最高的一種方法，但此種方法是否能達(dá)到所報道的酶活力，尚待測定。在這些方法中樹脂吸附法相對成本較低，較經(jīng)濟(jì)，溶菌酶活力及收率均較高，可成功應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，提取溶菌酶的工藝簡單，投資少，但技術(shù)要求較嚴(yán)格，目前缺乏對其工業(yè)化步驟的深入研究。 溶菌酶分離純化的方法鑒于溶菌酶特殊的理化性質(zhì)及其在食品中的廣泛應(yīng)用，它的分離純化研究也一直受到追捧，已經(jīng)開發(fā)并建立起多種方法，總體說來主要概括有結(jié)晶法、色譜法、親和分離法、反膠團(tuán)萃取法、雙水相萃取法及超濾法等[7]。向溶菌酶含量最多的蛋清中加入一定量的中性鹽，如NaC（NH）4SO2等，然后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH至溶菌酶的等電點(diǎn)區(qū)(～)，再加入溶菌酶晶體，在低溫下靜置2—3周時間，溶菌酶晶體即可析出，而其他蛋清中大部分蛋白質(zhì)仍在溶液中。結(jié)晶法是目前提取分離蛋清中溶菌酶的首選方法，它要求溶菌酶的含量相對高點(diǎn)，因此不適宜分離微量的溶菌酶，故除了蛋清，其他來源的溶菌酶生產(chǎn)一般不用結(jié)晶法。因此單純的結(jié)晶法分離純化溶菌酶，存在著許多不穩(wěn)定的因素。與常規(guī)的結(jié)晶方法相比，膜結(jié)晶具有結(jié)晶過程可控、結(jié)晶誘導(dǎo)時間短，蛋白質(zhì)初始濃度低等優(yōu)點(diǎn)。 色譜法(1)離子交換色譜法離子交換色譜法是以具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相，利用它與流動相中的離子能進(jìn)行可逆的交換性質(zhì)和結(jié)合力的差異來分離離子型化合物的一種方法。由于溶菌酶是一種堿性蛋白質(zhì)，最適宜的酸度為pH ，因此制備溶菌酶時，一般選用弱酸性陽離子交換樹脂。(2)親和色譜法親和色譜也稱為親和層析，是一種利用固定相的結(jié)合特性來分離分子的色譜方法。親和層析應(yīng)用始于20世紀(jì)70年代，由于底物可以專一性與溶菌酶結(jié)合，進(jìn)而與其它蛋白分離，是一種高效的分離方法。(3)分配色譜法分配色譜法是利用固定相與流動相之間對待分離組分溶解度的差異來實現(xiàn)分離。 親和分離法親和分離法是一種以親和力為基礎(chǔ)的分離純化方法，利用物質(zhì)問的特異性結(jié)合力，使得目的物質(zhì)或者雜質(zhì)與相應(yīng)的配基結(jié)合，達(dá)到相互分離的目的。親和沉淀法是采用在物理場(pH、離子強(qiáng)度和溫度等)改變時發(fā)生可逆性沉淀的水溶性聚合物為親和配基的載體，從而利用目標(biāo)分子與其親和配基的特異性結(jié)合作用及沉淀分離的原理進(jìn)行目標(biāo)大分子的分離純化，是蛋白質(zhì)等生物大分子的新型親和技術(shù)之一。此外親和沉淀操作中目標(biāo)分子與配基的親和相互作用在水溶狀態(tài)下，傳質(zhì)阻力小、吸附速率快、可處理高粘度甚至含微粒的粗原料[6]。固體親和層析法是指蛋白質(zhì)分子能夠與金屬離子發(fā)生親和反應(yīng)并與之結(jié)合，用于分離純化蛋白質(zhì)。它的優(yōu)點(diǎn)是可用不同的金屬離子固定到螯合載體上，用一種更強(qiáng)的螯合劑將所用的螯合劑洗脫下來從而實現(xiàn)再生。當(dāng)體系中含量一定量的水，則在反膠團(tuán)中心有一個水池，可以包圍水溶性的蛋白質(zhì)分子。 雙水相萃取法當(dāng)兩種高聚物的的水溶液相互混合時，若兩種被混合分子間存在空間排斥作用，使它們之間無法相互滲透，則在達(dá)到平衡時就有可能分成兩相，形成雙水相。一般認(rèn)為，只要兩種聚合物水溶液的水溶性有所差異，混合時就可以發(fā)生相分離，并且差別越大，相分離傾向就越大。聚乙二醇／無機(jī)鹽中所用的無機(jī)鹽主要是磷酸鹽和硫酸鹽。與傳統(tǒng)的分離技術(shù)相比，它的特點(diǎn)是產(chǎn)出量高，活性大，雜質(zhì)少，純度也較高。蛋殼重量占整個雞蛋的11%～13%，殼內(nèi)膜約占蛋殼重量的4%～5%。蛋類是全人類共同的優(yōu)質(zhì)動物性食品，隨著禽蛋生產(chǎn)與消費(fèi)的日益增加，其不可食用部分——蛋殼就大量產(chǎn)生，在一個千萬人口的城市，如每人每日丟棄一個蛋殼，按通常蛋殼在全蛋重量中的比重計算，一年下來，其量之巨，需5700輛5t大貨車才能裝運(yùn)。在各類動物性食品的廢棄物中，其骨、皮、血的資源化程度較高，市場上有多種骨鈣補(bǔ)劑、氨基酸、膠原蛋白功能制劑等，但尚未見到蛋殼鈣劑、蛋殼蛋白、蛋殼膠原等商品，蛋殼的開發(fā)利用明顯滯后，這與長期以來蛋殼來源十分分散有直接關(guān)系?，F(xiàn)代蛋制品加工業(yè)的發(fā)展將在很大程度上改變蛋殼來源分散、不易收集、污染嚴(yán)重的現(xiàn)狀，因此，對蛋殼資源化研究與開發(fā)具有重要的理論與實踐意義[9]。 本課題主要研究內(nèi)容 本課題以蛋殼綜合利用為目的，主要內(nèi)容包括蛋殼溶菌酶的分離純化、溶菌酶酶活性質(zhì)研究。第2章 溶菌酶的提取、鑒定和酶活力的測定第2章 溶菌酶的提取、鑒定和酶活力的測定 實驗材料和藥品實驗材料：雞蛋殼（去校外超市購買）實驗藥品：表21 實驗所用藥品藥品名稱純度/濃度氯化鈉≥%（分析純）氫氧化鈉≥%無水氯化鈣≥%（分析純）碳酸鈉≥%（分析純）聚丙烯酸PAA冰醋酸99%（分析純）鹽酸36%38%（分析純）磷酸二氫鉀≥%（分析