【正文】 果，只有選擇 最佳的生 長 環(huán)境和代謝合成產(chǎn)物的最佳環(huán)境才能最大限度的發(fā)揮出菌株的潛在能力，實(shí)現(xiàn)研究的最高價(jià)值。 碳源是發(fā)酵過程中合成菌體及抗生 素的能量和碳素來源；氮源是用來構(gòu)成菌體的蛋白質(zhì)、核酸等含氮物質(zhì) 以及抗生素等含氮代謝產(chǎn)物的；磷是核酸和蛋白質(zhì)的必要組成成分，也是重要的能量傳遞者 ATP的主要 成分；酪氨酸是林可霉素合成的前提物質(zhì)，培養(yǎng)基成分中酪氨酸的含量對(duì)產(chǎn)量有一定的影響。本實(shí)驗(yàn)選擇了以淀粉、葡萄糖（碳源），玉米漿、豆餅粉（氮源），磷酸二氫鉀（磷酸鹽）和前體酪氨酸等因素 為研究對(duì)象 ，以確定林可霉素發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基配比。 實(shí)驗(yàn)主要儀器 表 11 主要儀器 儀器名稱 產(chǎn)家 恒溫恒濕振蕩培養(yǎng)箱 SPH2102C SPX250BSⅡ生化培養(yǎng)箱 電子天平 FC104雙圈牌 恒溫水浴鍋 HH2 立式電熱壓力蒸汽滅菌器 LDZX50KBS PHSJ3F 實(shí)驗(yàn)室 pH計(jì) 雷磁牌 離心機(jī) 顯微鏡 XSP2CA 滴定裝置 培養(yǎng)皿 牛律杯 200ul移液槍 X57404E 游標(biāo)卡尺 LINKS BRAND 馬頭牌 JYT5架盤藥物天平 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 SWCJ2FD雙人單面凈化工作臺(tái) 上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司 上海精科 國華電器有限公司 上海申安醫(yī)療器械廠 上海精密科學(xué)儀器有限公司 中外合資深圳天南海北有限公司 上海 天律市東麗教學(xué)儀器廠 上海五一玻璃儀器廠 上海市藥品研究所 法國 制造 哈爾濱量具刀具廠 上海醫(yī)用激光儀器廠 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司 蘇州凈化設(shè)備有限公司 此外還 需要的儀器 有 燒杯、電爐、三角燒瓶、 接種鏟、陶瓦蓋 等 。 培養(yǎng)基 配方 的配制 李陽 林肯鏈霉菌產(chǎn) 林可霉素發(fā)酵培養(yǎng) 基 的優(yōu)化 4 可溶 性 淀粉 %（ 單獨(dú)糊化 ）、 豆餅粉 %、 瓊脂 %， %、 KNO3 %、K2HPO4 %、 FeSO4?7H2O %(現(xiàn)配現(xiàn)用 )、 MgSO4 %(最后加入 )、 蒸餾水配制 ，pH 消前自然 ， 消后 。 培養(yǎng)基 的配制 淀粉 %、 葡萄糖 %、 豆 餅 粉 %、 硫酸銨 %、 玉米漿 %、 碳酸鈣 %，消前 ， 消后 177。 的配制 淀粉 %、葡萄糖 %、豆 餅 粉 %、 玉米漿 %、 氯化鈉 %、硝酸鈉 %、硫酸銨 %、碳酸鈣 %、磷酸二氫鉀 %，消前 ，消后 （ 調(diào)節(jié)后再加入碳酸鈣 ),搖瓶培養(yǎng)基裝量 10%。 以上培養(yǎng)基均在 121℃下滅菌 20min。 斜面指標(biāo)：密的背后黃色，稀的背后褐色至棕褐色。 接入林肯鏈霉菌，接種量 1525個(gè)菌落 /瓶，培養(yǎng)條件：溫度 30?C，濕度 45%， 轉(zhuǎn)速 180r/min， 培養(yǎng) 54h。 發(fā)酵培養(yǎng) 方法 按 好發(fā)酵培養(yǎng)基后， 裝量： 25mL/250mL， 50mL/500mL。 培養(yǎng) 條件：溫度 30℃、濕度 45%、轉(zhuǎn)速 220r/min，培養(yǎng) 9d。 一分子氨鹽與甲醛作用，生成六次甲基四胺及一分子無機(jī)酸，后者以堿滴定，從而標(biāo) 定 出氨 氮含量，氨基氮氨基酸的氨基與甲醛結(jié)合，使氨基酸堿性消失，再用標(biāo)準(zhǔn)液來滴定羧基，標(biāo)出氨基氮 。 稱取 100mL容量瓶中，定容，搖勻，后標(biāo)定為 。 酚酞批示劑（ %酚酞乙醇水溶液） 稱取 酚酞置于 100mL 小燒杯中，加入 100mL 無水乙 醇充分?jǐn)嚢枋谷芙?，將溶液轉(zhuǎn)至 100mL試劑瓶中待用， pH變色范圍 為 (無色變紅 )。 操作步驟 吸取待測(cè)液 (發(fā)酵液上清液 ) 250mL三角燒杯中，加水約 50mL，加甲基紅批示劑 23 滴，加 1NHCl 12 滴，使成紅色，放置 3min，然后再以 NaOH 調(diào)至橙黃色，加入中性甲醛 10mL，放 置 510min，加酚酞指示劑 1mL，用 NaOH滴定至粉紅色為終點(diǎn) 。 標(biāo)準(zhǔn)葡 萄糖溶液 準(zhǔn)確稱取 （ 177。 斐林試劑 A液：稱取 120g 無水硫酸銅，用蒸餾水溶解并稀釋至 2022mL。 C液：稱取 300g 碘化鉀，用蒸餾水溶解并稀釋至 1000mL。 李陽 林肯鏈霉菌產(chǎn) 林可霉素發(fā)酵培養(yǎng) 基 的優(yōu)化 6 斐林試劑的標(biāo)定 精確量取 10mL 的新配斐林試劑至 250mL 錐形瓶中，加入 ，輕輕振蕩均勻后，用 。 精確量取糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 、 、 、 、 、 、 、 、 加入 150mL 的三角瓶中，精確加入 10mL 的斐林混合液， 100?C 沸水浴 10分鐘后，取出冷卻至室溫，用酸式滴定管加入 ，邊加邊輕輕震蕩，使鹽酸與三角瓶內(nèi)溶液充分接觸，用硫 代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定溶液將現(xiàn)乳白色時(shí)，加入 12mL %淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至藍(lán)色剛好消失，同時(shí)以 10mL 斐林試劑作空白，以葡萄糖量（ g/100mL）為縱坐標(biāo)，空白滴定數(shù)減去樣品滴定數(shù)為橫坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 。 空白的測(cè)定 以蒸餾水 10mL,準(zhǔn)確加入斐林試劑 20mL,加 6NHCl 10mL,作空白實(shí)驗(yàn)，同樣以 Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，得空白 Na2S2O3毫 升 數(shù)，查標(biāo)準(zhǔn)曲線求得糖含量。 抗生素效價(jià) 測(cè)定技術(shù) [12] 原理 抗生素生物效價(jià)的測(cè)定方法有物理方法、化學(xué)方法及微生物方法。微生物方法有比濁法、瓊脂擴(kuò)散法等，其中瓊脂擴(kuò)散法中的管碟法最為常用。常用二劑量法計(jì)算效價(jià)。二劑量法是相對(duì)效價(jià)的計(jì)算方法，因此在效價(jià)計(jì)算中，即使不知道待檢品濃度稀釋液和低濃度稀釋液的具體濃度值，也不會(huì)影響效價(jià)的計(jì)算結(jié)果。 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨 6g/L、酵母膏 6g/L、牛肉膏 、葡萄糖 1g/L、瓊脂15g/L， － 。 準(zhǔn)確稱取 KH2PO48g和 K2HPO42g， 置 1000mL 容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，滅菌備用。 ） ，用 一定濃度的原液，再將此原液 逐步 釋成 6U/mL 和 3U/mL（ 2： 1）兩種溶液。 混菌平板的配制 制備底層培養(yǎng)基平板，用大口吸管吸取 20mL已加熱熔化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，注入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，均勻鋪滿皿底，待凝固后作為底 層培養(yǎng)基。 效價(jià)測(cè)定 （ 1） 加牛津杯：待含菌薄層平板完全凝固后，在培養(yǎng) 皿底部劃分成四區(qū)，并做標(biāo)記，中 心部位貼一標(biāo)簽紙，在紙的四 角相應(yīng)位置注明加入藥物的名稱。 （ 2） 加藥液：用移液槍分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品和待檢品各兩種濃度的藥液 2mL，分別注滿相應(yīng)的牛津杯內(nèi)，四個(gè)牛津杯內(nèi)加的藥量要一致。 測(cè)量抑菌圈直徑：用游標(biāo)卡尺 精確測(cè)量每種藥液的抑菌圈直徑。 將培養(yǎng)好的培養(yǎng)液準(zhǔn)確量取 10mL， 2022 轉(zhuǎn)離心 10min，量取上清液。過于年輕的種子移入發(fā)酵培養(yǎng)基中，會(huì)出現(xiàn)前期生長緩慢，使整個(gè)發(fā)酵周期延長；過老的種子則會(huì)使菌體過早自溶，生產(chǎn)能力下降 ，因此選擇適當(dāng)?shù)慕臃N齡十分重要 。 本實(shí)驗(yàn)對(duì) 種子 的代謝情況進(jìn)行了考察，其結(jié)果見下表： 表 2－ 1 種子 代謝狀況 時(shí)間 pH 菌濃 還原糖 氨基氮 （ h） (%） （ mg/100mL） （ mg/100mL） 0 5 24 6 36 14 48 18 52 22 54 28 24h 36h 48h 54h 圖 2－ 1 菌種在不同時(shí)期 的 菌體狀態(tài) 由表 21中 可以看出 當(dāng)種子培養(yǎng)到 54h時(shí)，已達(dá)到 種子移種指標(biāo)，即 還原糖 、氨基氮 6080mg/mL、菌濃 2228%、 － 。 此時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)均已達(dá)標(biāo)，可以移種。隨著菌體的生長，消耗 有機(jī)酸、酸性物質(zhì) 等酸性物質(zhì)造成的，也可能是菌體產(chǎn)生了一些堿性物質(zhì)，使 pH上升。 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 在 林肯鏈霉菌培養(yǎng)基的優(yōu)化 中 碳源、氮源以及無機(jī)鹽離子 是很重要的控制因素 [13， 14]，他們 提供了微生物生長、繁殖、代謝和合成人們所 需產(chǎn)物的營養(yǎng)物質(zhì)和原料。 常用的碳源有糖類、 油脂、有機(jī)酸和低碳醇。 葡萄糖作為微生物 的主要 碳源，在培養(yǎng)基中的含量也會(huì)對(duì)發(fā)酵有一定的影響， 微生物 在 生長過程中， 葡萄糖 屬于 速效碳源，微生物首先會(huì)利用葡萄糖，當(dāng)葡萄糖的濃度很高時(shí)菌體 會(huì)表現(xiàn)出“葡萄糖效應(yīng)”， 所謂的“葡萄糖效應(yīng)”是指在微生物培養(yǎng)過程中當(dāng)周圍環(huán)境中 的 葡萄糖 濃度過高時(shí)會(huì) 抑制 微生物利用其他的碳源 ， 直到葡萄糖耗盡或低于一定濃度為止。 氮源也是微生物生長的主要必須物質(zhì)之一，微生物 在生長期菌體大 量繁殖，菌體的繁殖需要染色體的復(fù)制，而染色體的復(fù)制 則 需要大量的 N元素。 所以在培養(yǎng)基的優(yōu)化過程中，氮源的選擇以及濃度的大小對(duì)結(jié)果都有 很大的 影響。 硫酸銨是屬于速效氮源的一種， 資料 表明較高的硫酸銨濃度有利于菌體生長和生產(chǎn)能力的提高， 可能是硫酸銨作為了合成林可霉素的一分子了 [9]，但過高的氨含量會(huì)產(chǎn)生氨阻遏作用。在保持 氯化鈉 %、硝酸鈉 %、碳酸鈣 %、磷酸二氫鉀 %不變的情況下設(shè)計(jì)了 L9(34)[16]正交試驗(yàn)表 考察淀粉、葡萄糖、豆粉、硫酸銨及玉米漿對(duì)發(fā)酵單位的影響。 四個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)的影響大小分別為 玉米漿 ＞ 淀粉 +葡萄糖 ＞ 硫酸銨 ＞ 豆餅粉 。原因可能是因?yàn)橛衩诐{是一種容易被微生物利用的良好氮源，它富含豐富的氨基酸、還原糖、磷、微量元素和生長素，且其中含有的磷酸 肌醇對(duì)促進(jìn)林可霉素的合成 有 積極作用。 加入的葡萄糖含量為 10%，說明 10%葡萄糖濃度為菌體的生長提供了豐富的碳源和能源，而沒有產(chǎn)生“葡萄糖效應(yīng)”。 李陽 林肯鏈霉菌產(chǎn) 林可霉素發(fā)酵培養(yǎng) 基 的優(yōu)化 12 圖 22 不同時(shí)間 正交試驗(yàn) 測(cè)量 結(jié)果 線形圖 從 22圖中可以看出 2號(hào)瓶中加入的 量分別 為 淀粉 +葡萄糖（ 1+10%） 、 豆餅粉 %、玉米漿 %、 硫酸銨 %。從 120h到 164h 2號(hào) 瓶 效價(jià)能力增加的速度并不快，但從 164h到 215h 2 號(hào)效價(jià)能力增加的速度 卻 超過了其他各組，原因可能是 2號(hào)培養(yǎng)基適合菌體的生長， 前期 時(shí) 菌體大量繁殖 ，使后期產(chǎn)生效價(jià)的速度加快 。 7號(hào)瓶中加入的 量分別為 淀粉 +葡萄糖（ 4+7%） ，豆餅粉 %，玉米漿 %，硫酸銨%。 7號(hào) 瓶 中葡萄糖加入量 為 7%是最少的，葡萄糖的量能促進(jìn)林肯鏈霉菌的生長，但同時(shí)也表明葡萄糖很可能對(duì)林可霉素的合成有一定的抑制作用。 磷酸鹽的影響 磷是核酸和蛋白質(zhì)的必要組成成分，也是重要的能量傳遞者 三磷酸