【正文】 280=。 在兩性離子中 ， 氨基是以質子化 (NH3+)形式存在 ，羧基是以離解狀態(tài) (COO)存在 。+H+H+C O O C HH 3 N +R H+H++pK239。 As an acid（ proton donor） ： As a base（ proton acceptor）： H 2 N C HC O ORH 3 N C HC O OR++ H +H 3 N C HC O O HRH 3 N C HC O OR+ + H + +不同 pH時氨基酸以不同的離子化形式存在： 氨基酸所帶靜電荷為 “ 零 ” 時，溶液的 pH值稱為該氨基酸的等電點（ isoelectric point），以 pI表示。 當溶液的 pH=pI時，氨基酸主要以兩性離子形式存在。 pHpI時，氨基酸主要以負離子形式存在 。這一 pH值即為氨基酸的等電點，簡稱 pI。 側鏈不含離解基團的中性氨基酸，其等電點是它的pKa1和 pKa2的算術平均值： pI = (pKa1 + pKa2 )/2 同樣，對于側鏈含有可解離基團的氨基酸，其 pI值也決定于兩性離子兩邊的 pKa值的算術平均值。在酸性溶液中（ pH pI)帶正電荷；在堿性溶液中（ pHpI)帶負電荷。 (1)與茚三酮的反應 氨基酸與水合茚三酮共熱，發(fā)生氧化脫氨反應，生成 NH3與酮酸。 加熱過程中酮酸裂解，放出 CO2，自身變?yōu)樯僖粋€碳的醛。 NH3與水合茚三酮及還原型茚三酮脫水縮合，生成藍紫色化合物。g/ml （不釋放 NH3） ? 應用： （先用層析法分離） ： 用陽離子交換樹脂，將樣品中的氨基酸分離，自動定性定量，記錄結果。 ? 應用：氨基酸定量分析 —甲醛滴定法（間接滴定） ，終點 pH過高（ 12），沒有適當指示劑。 ，相當于一個氨基（摩爾比 1： 1） ，一般用于測定蛋白質的水解速度。此法的特點是能夠不斷重復循環(huán)，將肽鏈 N端氨基酸殘基逐一進行標記和解離。 ? 多肽順序自動分析儀 ? 樣品最低用量可在 5pmol （ 5） 與熒光胺的反應 ?α NH2的反應 ?氨基酸定量 （ 6） 與 5,5’雙硫基 雙 (2硝基苯甲酸 )反應 ?SH的反應 ?測定細胞游離 SH的含量 （ 7）其他反應 ?成鹽、成酯、成肽、脫羧反應 Section 5 氨基酸的分析分離 ? 常用的方法有： ? 濾紙層析法 (filterpaper chromatography: FPC) ? 薄層層析法 (thinlayer chromatography: TLC) ? 離子交換層析法 (Ionexchange column chromatography: IEC) ? 氣液色譜法 (gasliquid chromatography : GLC) ? 高效液相色譜法（ high performance liquid chromatography: HPLC) ? 電泳技術 一、濾紙層析法（ FPC) ?以濾紙作為支持物。（主要與物質的極性有關） 分配系數(shù) （ Ka)= 溶劑在流動相中的濃度 /溶劑在固定相中的濃度 遷移率 （ Rf) = 原點到層析中心點的距離 /原點到層析前沿的距離 即在一定條件下，被分離物質在紙上移動的距離與溶劑移動的距離之比。 可利用兩種不同的展層劑，進行雙相層析（詳見 P151圖 325）。根據(jù)所帶基團又可分為： 陽離子交換劑 含 SO3H （強酸型） H型 COOH（弱酸型） 若以 Na+置換 H+: SO3Na Na型 COONa 陰離子交換劑： 含 N+(CH3)3OH（強堿型） OH型 N+H3OH （弱堿型） 若以 Cl置換 OH, N+(CH3)3Cl Cl型 N+H3Cl 如： 732型陽離子交換樹脂（ pH12)分離 aa: (1)轉型：由 H型 → Na型 （ 2）上樣：混合 aa （ 3）洗脫：提高洗脫液的 pH或離子強度 aa的洗脫順序：先酸性 aa、再中性 aa、后堿性 aa。 蛋白質存在于所有的生物細胞中，是構成生物體最基本的 結構 物質和功能物質 。 Chapter 4 蛋白質的共價結構 Section 1 概 述 一、蛋白質的定義 蛋白質：是一切生物體中普遍存在的，由天然氨基酸通過肽鍵連接而成的生物大分子；其種類繁多，各具有一定的相對分子質量，復雜的分子結構和特定的生物功能；是表達生物遺傳性狀的一類主要物質。 ” 可以看出，第一，蛋白體是生命的物質基礎；第二，生命是物質運動的特殊形式，是蛋白體的存在方式；第三，這種存在方式的本質就是蛋白體與其外部自然界不斷的新陳代謝。某些蛋白質還含有其他一些元素，主要是磷、鐵、碘、碘、鋅和銅等。因此，可以將生物組織的含氮量近似地看作蛋白質的含氮量。 一般，樣品含氮量平均在 16%，取其倒數(shù) 100/16=，即為蛋白質換算系數(shù)，其含義是樣品中每存在 1g元素氮，就說明含有 蛋白質）；故： ※ 蛋白質含量 =氮的量 100/16 除了上述法方外，還有 紫外比色法 雙縮脲法 Folin—酚 考馬斯亮蘭 G—250比色法 （條件：蛋白質必須是可溶的） （兩種類型） 單純蛋白質：水解為 α氨基酸 結合蛋白質 =單純蛋白質 +輔基 四、 蛋白質的分類 一 . 依據(jù)蛋白質的外形分類 按照蛋白質的外形可分為球狀蛋白質和纖維狀蛋白質。 (fibrous protein)分子類似纖維或細棒。 二 .依據(jù)蛋白質的組成分類 按照蛋白質的組成，可以分為 (simple protein) ：又稱為單純蛋白質；這類蛋白質只含由 ?氨基酸組成的肽鏈，不含其它成分。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。 （ 3）精蛋白和組蛋白：堿性蛋白質，存在與細胞核中。 (conjugated protein)： 由簡單蛋白與其它非蛋白成分結合而成 （ 1）色蛋白：由簡單蛋白與色素物質結合而成。 （ 2）糖蛋白：由簡單蛋白與糖類物質組成。 （ 3）脂蛋白：由簡單蛋白與脂類結合而成。 （ 4）核蛋白：由簡單蛋白與核酸結合而成。 （ 5）色蛋白：由簡單蛋白與色素結合而成。 （ 6）磷蛋白：由簡單蛋白質和磷酸組成。 Section 2 肽 (peptide) ?蛋白質是由一條或多條多肽 (polypeptide)鏈以特殊方式結合而成的生物大分子。 ?蛋白質分子量變化范圍很大 , 從大約 6000到 1000000道爾頓甚至更大 一 . 肽 ?一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物稱為肽。組成多肽的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。 ? 氨基酸的順序是從 N端的氨基酸殘基開始，以 C端氨基酸殘基為終點的排列順序。 ?組成肽鍵的原子處于同一平面。 ?在大多數(shù)情況下，以反式結構存在。 ?但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。 ?如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。 ★其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質生物功能的基礎 。自從 1953年，現(xiàn)在已經有上千種不同蛋白質的一級結構被測定。 ，計算酰胺的含量。幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用 8mol/L尿素或 6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈 (亞基 ). ② 測定蛋白質分子中多肽鏈的數(shù)目： 通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數(shù)目?？稍诳捎?8mol/L尿素或 6mol/L鹽酸胍存在下， 用過量的 ?巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。 ★ 巰基的保護 O O C C H C H2 S HN H 3 +I C H 2 C N H 2OC H 2 O C C lOC H 2 C l O O C C H C H2 SN H 3 +O C C H 2OC H 2 O O C C H C H 2 SN H 3 +C H 2 C N H 2O O O C C H C H2 SN H 3 +④ 測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比； ⑤分析多肽鏈的 N末端和 C末端 ★ 末端氨基酸的測定： 多肽鏈端基氨基酸分為兩類， N端氨基酸和 C端氨基酸。末端氨基酸測定的主要方法有： A. 二硝基氟苯（ DNFB）法 B. 丹磺酰氯法 :在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與 N端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰 氨基酸。 N ( C H 3 ) 2S O 2 C lH 2 N C H CR OH N C H CR OS O 2N ( C H 3 ) 2+水解N ( C H 3 ) 2S O 2 H N C H CR OO H+ 氨基酸丹磺酰氯多肽 N 端丹磺酰 N 端氨基酸丹磺酰氨基酸C. 肼解法： 此法是多肽鏈 C端氨基酸分析法。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質而與 C端氨基酸分離 。根基不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應時間和氨基酸殘基釋放量作動力學曲線，從而知道蛋白質的 N末端殘基順序。 E. 羧肽酶法： 羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的 C端逐個的水解。目前常用的羧肽酶有四種： A,B,C和 Y； A和 B來自胰臟； C來自柑桔葉； Y來自面包酵母。 ⑥ 多肽鏈斷裂成多個肽段 ，可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。 C H 3