【正文】 章 主要內(nèi)容 ? 1. 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) ? 2. 蛋白質(zhì)分離純化的常用方法 ? 3. 電泳技術(shù) 1．蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) ? （ 1）蛋白質(zhì)的兩性電離特性 ? （ 2）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) ? （ 3）蛋白質(zhì)的沉淀特性 ? （ 4）蛋白質(zhì)的變性 ? （ 5）蛋白質(zhì)的紫外吸收特性 ? （ 6）蛋白質(zhì)的顯色反應 （ 1）蛋白質(zhì)的兩性電離特性 ? 蛋白質(zhì)的等電點：當?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的 pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點。 （ 2）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) ? 由于蛋白質(zhì)屬高分子物質(zhì)（分子量范圍 10—1000 kDa），它在水中的顆粒大小約 1—100nm，能夠形成膠體溶液。 ? 蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如擴散慢、黏度大、不能透過半透膜等 ? 應用：由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。 ? 可逆沉淀：在沉淀過程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀（或可逆沉淀）。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。 ? 可逆變性：蛋白質(zhì)在變性后，除去變性因素仍可恢復其活性，稱為可逆變性（可逆變性也是蛋白純化中常用的一種手段）。 ? 蛋白質(zhì)變性的因素： ? 物理因素：高溫、高壓、紫外線、 X射線照射、超聲波、劇烈震蕩和劇烈攪拌等。 ? 生物學活性的喪失并不一定完全是變性的結(jié)果，如蛋白質(zhì)肽鏈水解斷裂、去除輔基和應用抑制劑等，均可導致蛋白質(zhì)失活。 ? 蛋白質(zhì)變性的發(fā)展 ? 結(jié)絮作用： 通過強酸 /強堿變性后的蛋白，當溶液的 pH調(diào)到其等電點時，蛋白質(zhì)會形成絮狀的不溶物，稱為蛋白質(zhì)的結(jié)絮作用。如：煮熟的雞蛋、豆腐的形成等。因此 280nm的光吸收度是蛋白質(zhì)的一種普遍性質(zhì)。 （ 6）蛋白質(zhì)的顯色反應 ? 茚三酮反應： 還原型的茚三酮可與氨基酸加熱分解產(chǎn)生的氨結(jié)合，再于另一分子茚三酮縮合成為藍紫色的化合物。由于此吸收峰值的大小與氨基酸釋放出的氨量成正比，因此可作為氨基酸定量分析方法。 2．蛋白質(zhì)分離純化的常用方法 ? （ 1）離心法 ? （ 2）沉淀法 ? （ 3）膜分離法 （ 1）離心法 ? 沉降速度法 /差速離心： 如果兩種蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)相差一個數(shù)量級以上，可用差速離心，反復多次達到分離效果。取上清，在更大的離心場中再離心，又會獲得一些沉淀物質(zhì)，如此反復多次，便可使混合物逐級被分開。在離心管中造成一個梯度密度環(huán)境，使介質(zhì)的最大密度大于分離物的最大密度。 ? 離心時離心管中的介質(zhì)是不均一的，從近中心到遠中心密度不斷增加，形成梯度。 （ 2）沉淀法 ? 等電點沉淀法： 蛋白質(zhì)分子在等電點時，凈電荷為零，分子之間的靜電排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。 ? 鹽析法： 在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性而使其析出。 ? 有機聚合物沉淀法： 有機 聚合物 沉淀劑與水分子通過氫鍵結(jié)合，使溶質(zhì)溶解度降低，從而得到沉淀。 （ 3）膜分離法 ? 定義 ? 分類 ? 根據(jù)推動力不同，可分為： ? 透析法 （ Dialysis， DS） （以膜兩側(cè)的濃度差為推動力） ? 膜過濾法 （以膜兩側(cè)的壓力差為推動力） ? 根據(jù)膜孔徑大小不同，膜過濾法可分為： ? 微過濾 （ Microfiltration， MF） ? 超濾 （ Ultrafiltration， UF） ? 反滲透法 （ Reverse osmosis， RO） ? 納濾法 (Nanofiltration， NF) 3．電泳技術(shù) ? （ 1）聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? （ 2）等電聚焦電泳 ? （ 3）雙向凝膠電泳 ? （ 4）毛細管電泳 （ 1）聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 聚丙烯酰胺凝膠的形成原理： 是由單體丙烯酰胺（ Acrylamide， Acr）和交聯(lián)劑 N， N甲叉雙丙烯酰胺（ Bisacrylamide， Bis），在加速劑四甲基乙二胺（ TEMED）和催化劑過硫酸銨（ AP）的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。如果緩沖液系統(tǒng)為不連續(xù)系統(tǒng)，還要加上 濃縮效應 （凝膠濃度的不連續(xù)性、離子成分及 pH的不連續(xù)性、電位梯度的不連續(xù)性）。 ? 濃度梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳 是指隨著凝膠濃度逐漸增高，凝膠孔徑逐漸減小，不同大小蛋白質(zhì)分子的移動就會在不同的區(qū)域受阻，形成較窄的區(qū)帶。蛋白質(zhì)在此體系中因解離而帶不同的電荷，其泳動率也不同。 （ 3）雙向凝膠電泳 ? 聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳（ 2DE）的第一向是等電聚焦電泳，第二向是 SDSPAGE。 ? 雖然 IEF/SDSPAGE的原理與 IEFPAGE、SDSPAGE單相電泳的原理基本相同 ， 但在具體操作上卻有較大的差別 。 ? 這些試劑可破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵 ， 使 蛋白質(zhì)變性 ，有利于第二相中 蛋白質(zhì)與 SDS充分結(jié)合 ； ? 這些試劑本身并不帶電荷 ， 不會影響蛋白質(zhì)原有的電荷量和等電點 。尿素在低溫時容易析出，在高溫時容易分解。使凝膠柱內(nèi)原有的第一相電泳分離系統(tǒng)被第二相的電泳分離系統(tǒng)所取代。 ? 經(jīng)平衡處理后的凝膠柱包埋在第二相的凝膠板上端，完成第二相電泳的加樣。它的分離原理是被分離物質(zhì)差速運動的結(jié)果。（理解電滲現(xiàn)象的基本概念） ? 物質(zhì)粒子在毛細管中的運動速度是這兩種運動速度之和。 ? 正離子的泳動方向與電滲方向相同，最先流出；中性離子的泳動速度為零，在正離子后流出；負離子的泳動方向與電滲方向相反，最后流出。 ? 2．免疫組織化學的具體應用 —— 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ ELISA）的基本原理和幾種不同的實驗方法；敘述使用雙抗體夾心法 /三明治法檢測某種蛋白質(zhì)的簡要步驟。 第五章 主要內(nèi)容 ? 1. 免疫組織化學 ? 2. 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ ELISA） ? 3. 免疫印跡法 （ Western blotting ） ? 4. 各種蛋白質(zhì)的定量檢測方法 1. 免疫組織化學 ? 免疫組織化學： 免疫學與組織化學相結(jié)合的一個分支學科。它把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡（包括熒光顯微鏡和電子顯微鏡等）的顯像和放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等），也可在原位顯示相應的基因和基因表達產(chǎn)物。 ? 1）抗原的提取和純化。 ? 3）抗體效價檢測和純化。 ? （ 2）抗原的檢測。 ? 2）免疫組織化學反應和顯色。 ? ABC法（ avidinbiotinenzyme plex， ABC） ：美籍華人 Hsu于1981年首次報道。 ABC法的操作過程 2. 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ ELISA） ? 基本原理： 先將已知抗體或抗原結(jié)合在某種固體載體上，并保持其免疫活性；利用標記技術(shù)，將酶標記到抗體（或抗原）上。 ? 實驗方法（分類） ? 間接法（用于測定抗體的常用方法） ? 雙抗體夾心法（用于測定抗原的常用方法） /橋連 ABCELISA夾心法 ? 競爭法（用于測定抗原、半抗原及抗體） 使用雙抗體夾心法 /三明治法檢測某種蛋白質(zhì) ? 向微孔板內(nèi)加入單克隆抗體進行包被， 4186。 ? 用 PBST洗滌 3次。C封閉反應 2 h或 4186。 ? 向微孔板內(nèi)加入待側(cè)樣品， 37186。 ? 用 PBST洗滌 3次。C反應 4560 min。 ? 顯色反應。 ? 酶標議檢測。 3．免疫印跡法 ? Western blotting/免疫印跡： 蛋白樣品經(jīng)過 SDSPAGE分離后，轉(zhuǎn)移到膜上，然后應用抗原抗體反應進行特異性檢測的方法。 ? 應用： 使用 Western blotting/免疫印跡法檢測某種蛋白質(zhì)。 ? 制備樣品，用 SDSPAGE電泳分離。 ? 將膜在封閉液中室溫反應 4560 min。 ? TBST漂洗 3 10 min。 ? TBST漂洗 3 10 min。將膜浸泡在 NBT/BCIP顯色液中，避光靜置，待出現(xiàn)清晰條帶后，把膜轉(zhuǎn)移至蒸餾水中中止反應。 ? 雙縮脲法。 ? 紫外 分光光度法。 ? BCA法 。 ? 2．國際上最著名的三大 DNA數(shù)據(jù)庫是什么？ 3. 世界上第一個專門從事蛋白質(zhì)序列、結(jié)構(gòu)、功能和蛋白質(zhì) 2DPAGE圖譜等的分析網(wǎng)站是什么？ ? 4．序列對比和數(shù)據(jù)庫搜索的基本概念：同源性和相似性的區(qū)別，數(shù)據(jù)庫搜索和數(shù)據(jù)庫查詢的區(qū)別。 ? 4．較廣泛的序列相似性搜索工具有那些？ 第六章 主要內(nèi)容 ? 1．蛋白質(zhì)的生物信息學的概念及內(nèi)容 ? 2．常用的幾個 DNA數(shù)據(jù)庫 ? 3．序列對比和數(shù)據(jù)庫搜索 ? 4．生物信息學研究的主要工具 1．蛋白質(zhì)的生物信息學的概念及內(nèi)容 ? 生物信息學的基本概念 ? 廣義上講，生物信息學是對生物信息的獲取、加工、儲存、發(fā)布、分析和解釋，并綜合運用數(shù)學、計算