【正文】 。骨保護(hù)素（ OPG）和骨保護(hù)素配體（ OPGL）的發(fā)現(xiàn)證實(shí)了這一假說(shuō)，并提供了分子基礎(chǔ) [1314]。 從以上研究中可以看出：（ 1）力學(xué)刺 激導(dǎo)致 OB、 OC 基因改變的過(guò)程涉及眾多基因的變化，但針對(duì)個(gè)別基因的研究顯得較為凌亂，基因之間的相互影響也不清楚，不能精確地闡明各基因在這一過(guò)程中的作用。這些不同信號(hào)通道是如何介導(dǎo)力學(xué)刺激，而導(dǎo)致 OB、 OC 基因表達(dá)的時(shí)空變化？是否存在某些尚不為人所知的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子？信號(hào)通路之間又是如何耦聯(lián)的？這方面的認(rèn)識(shí)尚不明確，只能從基因表達(dá)的變化來(lái)找尋方向。 因此，有必要同期從體內(nèi)外觀察 OB、 OC 受力后整個(gè)基因表達(dá)的時(shí)序變化，探討各相關(guān)基因在骨形成和骨吸收過(guò)程中的確切作用，并探討其臨床應(yīng)用前景和意義?；蛐酒夹g(shù)是一項(xiàng)新興的能檢測(cè)全范圍 mRNA 表達(dá)水平變化的技術(shù)，具有高通量、并行化 的特點(diǎn)，可為研究基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其機(jī)理，揭示不同層次多基因相互作用的生理、病理現(xiàn)象提供有效手段 [17,18]。激光捕獲顯微切割技術(shù) [19]（ Laser Capture Microdissection ， LCM）則是解決細(xì)胞異質(zhì)性問(wèn)題的革命性技術(shù)，是在顯微鏡下從組織切片中分離、純化單一類(lèi)型細(xì)胞群或單個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。因此，我們相信 LCM 技術(shù)與基因芯片的有效結(jié)合，將能夠清晣地勾畫(huà)出 力學(xué)刺激后人工種植體 骨界面 OB、 OC 在 生理、病理過(guò)程中的基因表達(dá)的改變。因此有必要從整個(gè)基因組的水平探討應(yīng)力作用下骨系細(xì)胞上千個(gè)基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)，既要從分子水平來(lái)研究其機(jī)理，也要從系統(tǒng)層面動(dòng)態(tài)研究骨系細(xì)胞基因的時(shí)序變化，把 分析和綜合統(tǒng)一起來(lái)，同時(shí)也可以對(duì)目前眾多單基因水平的研究進(jìn)行分析、評(píng)價(jià)和比較，從而明確不同力學(xué)刺激導(dǎo)致骨形成和骨吸收的基因調(diào)控的異同，試圖發(fā)現(xiàn)新的重要的調(diào)控基因，篩選出能特異性表明骨形成和骨吸收的“標(biāo)記”基因，不僅為骨生物力學(xué)及骨組織工程學(xué)提供理論依據(jù)，而且對(duì)負(fù)荷狀態(tài)下骨組織與人工材料界面骨改建機(jī)制的認(rèn)識(shí)、臨床診斷和防治等也有重要的意義。201(6):43746. Femor B,Cundle R, Evans M,et human osteoblast proliferation and prostagland in E2 release in response to mechanical strain in vitro. Bone ,1998。537(13):11720. Kletsas,Dimitris,Basdra,et al. Effect of proteinkinase Inhibitor on the stretchelicited cfos and cjun upregulation In human PDL osteoblastlike cells [J].Cell Physiol,20xx,190(3):313— 321. 6 、 Ikegame M,Ishibashi O,YOSHIZAWA T,et stress Induces bone morphogeic protein 4 in preosteoblastic and fibroblastic cells,which later differentiate into osteoblasts leading to osteogenesis in the mouse calvariae in an culrure [J]Bone Miner Res,20xx,16(1):2432. Pavlin D, Zadro R, GluhakHeinrich J. Temporal pattern of stimulation of osteoblastassociated genes during mechanicallyinduced osteogenesis in vivo: early responses of osteocalcin and type I collagen. Connect Tissue Res. 20xx Oct。52(6):52733. Winter LC, Walboomers XF, Bumgardner JD, Jansen versus continuous stretching effects on osteoblastlike cells in vitro. J Biomed Mater Res. 20xx Dec 15。 24(18): 313951. 1 Rosenberg role of the cytoskeleton in mechanotransduction in human osteoblastlike Exp Toxicol. 20xx May。15(7):134653. 1 Filippo G,Giancotti and Erkki Ruoslahti . Science 1999 August 13。20(2):18792. 1 Vaes BL, Dechering KJ, Feijen A, et microarray analysis of bone morphogeic protein 2induced osteoblast differentiation resulting in the identification of novel markers for bone Bone Miner Res. 20xx Dec。31(3):295303. Ying SY, Lin expression in precursor cells of prostate cancer associated with activin by bination of subtractive hybridization and microarray Biophys Res Commun. 20xx Jan 2。 研究?jī)?nèi)容： 第一部分 ：建立將力學(xué)刺激傳遞到骨系細(xì)胞的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證間斷力學(xué)刺激與骨形成和骨破壞之間的關(guān)系，確定本實(shí)驗(yàn)中擬采用的“生理”負(fù)荷和“超”負(fù)荷的標(biāo)準(zhǔn)力值。 第三部分 : 利用激光捕獲顯微分離技術(shù) , 采集動(dòng)物模型體內(nèi)種植體 — 骨界面區(qū)域的 OB 和 OC,再用基因芯片法檢測(cè)“生理”負(fù)荷和“超”負(fù)荷下各 類(lèi)細(xì)胞 基因表達(dá)譜的時(shí)序變化。 第五部分： 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較體內(nèi)外 OB、 OC 基因表達(dá)的時(shí)序變化和差異，分析從骨形成到骨破壞過(guò)程中整個(gè)基因組表達(dá)的差異及其作用機(jī)制。 擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題 1）、建立動(dòng)物模型， 確定本實(shí)驗(yàn)中擬采用的“生理”負(fù)荷和“超”負(fù)荷的標(biāo)準(zhǔn)力值。 3）、通過(guò)體內(nèi)體外 OB 和 OC 基因表達(dá)譜差異的對(duì)比分析，探討 OB 和 OC 的耦聯(lián)機(jī)制。 5）、通過(guò)基因表達(dá)譜的比較，結(jié)合基因數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)，結(jié)合重要調(diào)控基因的發(fā)現(xiàn)，從整體角度分析負(fù)荷狀態(tài)下骨組織與人工材料界面 骨改建的機(jī)制， 為進(jìn)一步研究提供新的線(xiàn)索和思路。 研究方案 一）、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立及間斷力學(xué)刺激對(duì)骨系細(xì)胞影響的觀察 1）、選 6 月齡 SD 大鼠 60 只，雌雄各半，分別單側(cè)股骨植入純鈦種植體（Ф ，L 8）骨外暴露 4mm，以備加力用， 23 月后， X 光驗(yàn)證骨整合者備用。如種植體明顯松動(dòng)，停止加載，取材檢測(cè)。 4）、各指標(biāo)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確定臨界負(fù)荷及本課題將采用的“生理”負(fù)荷和“超”負(fù)荷的標(biāo)準(zhǔn)力值。（已積累經(jīng)驗(yàn)） 2）、將前期實(shí)驗(yàn)測(cè)出的標(biāo)準(zhǔn)“生理”負(fù)荷和“超”負(fù)荷換算 成大氣壓，通過(guò)氣壓加壓裝置間斷加力于體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，其力學(xué)參數(shù)參考前期實(shí)驗(yàn)。 (取樣時(shí)間點(diǎn)系根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)總結(jié)、臨床經(jīng)驗(yàn)、及參考相關(guān)文獻(xiàn)提出 ) 4）、將“生理”負(fù)荷和“超”負(fù)荷作用于破骨細(xì)胞，以 1h ,24h ， 48 h， 4d 為取樣點(diǎn)，未加力為對(duì)照，抽提 mRNA 后，逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記 cDNA ，應(yīng)用基因芯片技術(shù) 檢測(cè)成骨細(xì)胞基因表達(dá)譜的時(shí)序變化。 2）、 I 組：按“生理”負(fù)荷力值加載，隨機(jī)選 5 只大鼠，分成 6 小組，分別在1h 加載后，以及 24h, 48 h， 4d 加載（ 每天 3 次，每次 1 小時(shí)）后 取下大鼠股骨，分別分離種植體和骨組織，取與種植體交界處骨組織，采用激光捕獲顯微分離技術(shù)分別分離出成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，將每小組 5 個(gè)樣品的成骨細(xì)胞（或破骨細(xì)胞）等量混合，抽提 mRNA，逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記 cDNA, 基因芯片檢測(cè)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的基因表達(dá)譜（基因芯片為大鼠 Oligo 基因芯片， 6000 個(gè) cDNA 的微陣列，由北京博奧生物芯片有限公司協(xié)助制備）。 4）、 III 組：無(wú)負(fù)荷加栽組，與上兩組同期取種植體周?chē)墙M織，抽提成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞 mRNA，逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記 cDNA,因表達(dá)譜。 1）、樣品在做基因芯片檢測(cè)之前，提取部分細(xì)胞，標(biāo)記，液氮凍存?zhèn)溆谩＝Y(jié)合基因數(shù)據(jù)庫(kù)，分析這些基 因的主要功能及作用。 生理負(fù)荷 超負(fù)荷 基因芯片 基因芯片 基因芯片 基因芯片 體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞(OB)和破骨細(xì)胞 (OC) 體外培養(yǎng)的成骨 (OB)細(xì)胞和破骨細(xì)胞 (OC) 體外 OB、 OC 基因表達(dá)譜的時(shí)序變化 體外 OB、 OC 基因表達(dá)譜的時(shí)序變化 RTPCR 法檢測(cè) OB、 OC 表達(dá)差異最大的幾個(gè)基因； 結(jié)合基因