【正文】 如乙方仍未采取新的有效措施保證完成，或要求終止合同時，甲方將采取措施追回部分或全部科研以費，并在二至三年內(nèi)不受理課題負責(zé)人的科研任務(wù)。 6．乙方對科研資料負有保密責(zé)任。如向省科委、衛(wèi)生部等上一級主管部門申報時，應(yīng)通過甲方協(xié)同辦理。 2 本課題確定為 償撥款。課研思路清晰，研究方法先進，論證 可行，在國內(nèi)屬首創(chuàng)。 8 三、實現(xiàn)本課題預(yù)期目標已具備的條件 1．與本課題有關(guān)的研究工作基礎(chǔ) 本研究負責(zé)人在讀碩士研究生期間（ — ）曾參加國家“九五”攻 關(guān)課題 —— Alzheimer 病的流行病學(xué)調(diào)查，與該課題密切相關(guān)。 3） 試劑合可在國內(nèi)外生物技術(shù)公司購買。 3） 實驗數(shù)據(jù)的分析、處理。 5 5．本課題的情報查新情況及結(jié)論 ① 檢索關(guān)鍵詞（２―４個）： ② 檢索年限（前 3 年以上）： ③ 檢索刊物名稱（至少有３種系國外刊物）： ④ 檢索手段（光盤、手工、其它）： ⑤ 檢索結(jié)論： ⑥ 檢索機構(gòu)及檢索人蓋章 6 二、研究方 法和路線 １、 擬采取的研究實驗方法、步驟、技術(shù)路線及可行性、可靠性論證 方法、步驟、技術(shù)路線： 1） 腦脊液的收集：包括所有行腰穿（神經(jīng)內(nèi)科和非神經(jīng)內(nèi)科住院患者）時的腦脊液，除外有明顯出血的腦脊液，經(jīng)離心沉淀后分管于20℃ 冰箱中保存待測。腦脊液取材操作簡單，放射免疫法檢測受主觀干擾因素少，結(jié)果可靠。為 AD 的診斷提供實驗室依據(jù)。阿爾茨海默病患者腦脊液 Tau、Aβ 1 Aβ 142（ 43） 蛋白測及其臨床意義。 3． 王磊，袁錦楣，郝洪軍，等。臨床神經(jīng)病學(xué)雜志， 20xx，1： 35。雖然，國外新近有 腦脊液 Tau 蛋白和 Aβ正常值的報道 [7] ，但目前尚無國人 腦脊液 Tau 蛋白和 Aβ的參考正常值。 AD 患者腦脊液中 Aβ水平是增高還是降低，各家報道不一致 [14]。 2 一． 本研究的立項依據(jù)和目標 １．本課題研究的意義及同類研究工作國內(nèi)外研究現(xiàn)狀與存在問題，列出主要參考文獻 隨著社會人口逐步進入老齡化階段， Alzheimer 病（ AD）已成為人類的第四大死因。 AD 患者腦細胞內(nèi) Tau 蛋白磷酸化位點增多， Tau 蛋白呈異常磷酸化，腦 脊液中 Tau 蛋白的含量增多。 根據(jù)本課題要求，部分設(shè)備需購買某些零配件以滿足實驗要求，關(guān)鍵儀器及大型設(shè)備已具備，無需購買。 2）、 Zwick1454 自動材料萬能試驗機（ Ulm,Germany） 及氣壓加載容器可以保證課題需要。 5）、發(fā)現(xiàn)反映從骨形成到骨破壞這個質(zhì)的變化過程中的“標記”基因，進而探討其臨床意義。 1）、明確生理性負荷和超負荷的力學(xué)參數(shù)和時間參數(shù)，以及相應(yīng)的骨組織形態(tài)學(xué)的改變。 完成研究 方法技術(shù)路線中的第三部分，即 體內(nèi) 骨組織不同負荷和時間下成骨細胞和破骨細胞基因表達譜基因芯片檢測。 C）、骨形成和骨吸收不但和應(yīng)力有關(guān)，也和激素、生長因子等有密切的關(guān)系，而這是本課題沒有涵蓋的 ，這也為我們提出了以后發(fā)展的方向 結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)層面的研究，以期闡明骨形成、骨破壞的分子機理。 3）在體內(nèi)實驗中采用激光捕獲顯微分離技術(shù)（ LCM），從 骨組織與人工材料界面捕獲所需的成骨細胞和破骨細胞，使相關(guān)基因的檢測更加準確。 激光捕獲顯微分離技術(shù)（ Laser Capture Microdissection LCM）在軟組織應(yīng)用以很成熟，課題組成員有在骨松質(zhì)捕獲細胞的經(jīng)驗，所需設(shè)備 已具備。此二者對比，結(jié)合相同條件下體內(nèi)外基因表達譜的異同，我們預(yù)期能篩選出與骨形成、骨破壞以及信息耦聯(lián)密切相關(guān)的特異性基因，并可進一步研究其互關(guān)系。 激光捕獲 激光捕獲 生理負荷 超負荷 可行性分析： 項目是在大量查閱國際最新相關(guān)文獻資料，并結(jié)合申請者本人相關(guān)的前期工作的基礎(chǔ)上，采用了多種學(xué)科、多種技術(shù)相結(jié)合的綜合性研究方 法，從而保證了立題的新穎性、科學(xué)性和可靠性。結(jié)合基因數(shù)據(jù)庫，分析這些基 因的主要功能及作用。 4）、 III 組：無負荷加栽組，與上兩組同期取種植體周圍骨組織，抽提成骨細胞和破骨細胞 mRNA，逆轉(zhuǎn)錄標記 cDNA,因表達譜。 (取樣時間點系根據(jù)前期實驗總結(jié)、臨床經(jīng)驗、及參考相關(guān)文獻提出 ) 4）、將“生理”負荷和“超”負荷作用于破骨細胞，以 1h ,24h ， 48 h， 4d 為取樣點，未加力為對照，抽提 mRNA 后，逆轉(zhuǎn)錄標記 cDNA ，應(yīng)用基因芯片技術(shù) 檢測成骨細胞基因表達譜的時序變化。 4）、各指標經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，確定臨界負荷及本課題將采用的“生理”負荷和“超”負荷的標準力值。 研究方案 一）、實驗動物模型的建立及間斷力學(xué)刺激對骨系細胞影響的觀察 1）、選 6 月齡 SD 大鼠 60 只，雌雄各半，分別單側(cè)股骨植入純鈦種植體（Ф ，L 8）骨外暴露 4mm，以備加力用， 23 月后， X 光驗證骨整合者備用。 3）、通過體內(nèi)體外 OB 和 OC 基因表達譜差異的對比分析，探討 OB 和 OC 的耦聯(lián)機制。 第五部分： 統(tǒng)計學(xué)分析比較體內(nèi)外 OB、 OC 基因表達的時序變化和差異，分析從骨形成到骨破壞過程中整個基因組表達的差異及其作用機制。 研究內(nèi)容： 第一部分 ：建立將力學(xué)刺激傳遞到骨系細胞的動物實驗?zāi)Ｐ?，通過動物實驗驗證間斷力學(xué)刺激與骨形成和骨破壞之間的關(guān)系，確定本實驗中擬采用的“生理”負荷和“超”負荷的標準力值。20(2):18792. 1 Vaes BL, Dechering KJ, Feijen A, et microarray analysis of bone morphogeic protein 2induced osteoblast differentiation resulting in the identification of novel markers for bone Bone Miner Res. 20xx Dec。 24(18): 313951. 1 Rosenberg role of the cytoskeleton in mechanotransduction in human osteoblastlike Exp Toxicol. 20xx May。537(13):11720. Kletsas,Dimitris,Basdra,et al. Effect of proteinkinase Inhibitor on the stretchelicited cfos and cjun upregulation In human PDL osteoblastlike cells [J].Cell Physiol,20xx,190(3):313— 321. 6 、 Ikegame M,Ishibashi O,YOSHIZAWA T,et stress Induces bone morphogeic protein 4 in preosteoblastic and fibroblastic cells,which later differentiate into osteoblasts leading to osteogenesis in the mouse calvariae in an culrure [J]Bone Miner Res,20xx,16(1):2432. Pavlin D, Zadro R, GluhakHeinrich J. Temporal pattern of stimulation of osteoblastassociated genes during mechanicallyinduced osteogenesis in vivo: early responses of osteocalcin and type I collagen. Connect Tissue Res. 20xx Oct。因此有必要從整個基因組的水平探討應(yīng)力作用下骨系細胞上千個基因的動態(tài)表達，既要從分子水平來研究其機理，也要從系統(tǒng)層面動態(tài)研究骨系細胞基因的時序變化，把 分析和綜合統(tǒng)一起來，同時也可以對目前眾多單基因水平的研究進行分析、評價和比較，從而明確不同力學(xué)刺激導(dǎo)致骨形成和骨吸收的基因調(diào)控的異同，試圖發(fā)現(xiàn)新的重要的調(diào)控基因，篩選出能特異性表明骨形成和骨吸收的“標記”基因，不僅為骨生物力學(xué)及骨組織工程學(xué)提供理論依據(jù)，而且對負荷狀態(tài)下骨組織與人工材料界面骨改建機制的認識、臨床診斷和防治等也有重要的意義。激光捕獲顯微切割技術(shù) [19]（ Laser Capture Microdissection ， LCM）則是解決細胞異質(zhì)性問題的革命性技術(shù)，是在顯微鏡下從組織切片中分離、純化單一類型細胞群或單個細胞的技術(shù)。 因此，有必要同期從體內(nèi)外觀察 OB、 OC 受力后整個基因表達的時序變化，探討各相關(guān)基因在骨形成和骨吸收過程中的確切作用，并探討其臨床應(yīng)用前景和意義。 從以上研究中可以看出：（ 1）力學(xué)刺 激導(dǎo)致