【正文】 圍，為Alzheimer 病的診斷提供可靠的實驗室依據(jù)。正常腦細(xì)胞內(nèi) Tau 蛋白磷酸化位點很少，因而不易被磷酸化，腦 脊液中 Tau蛋白的含量較少。 課題類別 衛(wèi)生廳編號 湖南省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)技術(shù)研究課題計劃（合同） 申 請 書 課題名稱：腦脊液中 β 淀粉樣蛋白和 tau 蛋白的正常值及臨床意義的研究 湖南省衛(wèi)生廳 一九九三年十月制 簡 表 研究課題 名稱 (25 字內(nèi) ) 腦脊液中 β 淀粉樣蛋白和 tau 蛋白的正常值 及臨床意義的研究 類別 申請金額 2 萬元 起止年月 起 20xx 年 10 月 止 20xx 年 9 月 申請者 姓名 性別 男 出生年月 1966 年 7 月 專業(yè)技術(shù)職務(wù) 主治醫(yī)師 學(xué)位 博士 所在部門 工作單位 名稱 所在地 性質(zhì) 課題組 總?cè)藬?shù) 高級 中級 初級 輔助人員 博士 碩士 學(xué)士 參加單位 數(shù) 5 2 2 1 2 2 1 1 課題組主要成員∧ 含負(fù)責(zé)人∨ 姓名 年齡 專業(yè)技術(shù) 職務(wù) 年參加月數(shù) 工作單位 項目中的分工 簽章 35 主治醫(yī)師 全程 負(fù)責(zé) 44 副主任醫(yī)師 全程 協(xié)作 40 主任醫(yī)師 全程 負(fù)責(zé) 31 主管技師 全程 協(xié)作 28 醫(yī)師 全程 協(xié)作 1 研究內(nèi)容和意義摘要 ∧ 200字內(nèi)∨ 腦脊液中 β 淀粉樣蛋白（β Amyloid Protein, β AP， Aβ）是淀粉樣前體蛋白（ APP）在分泌酶的作用下裂解出來的含有 4043 個氨基酸的蛋白質(zhì)， 腦脊液中 Aβ有 Aβ 40和 Aβ 42兩種形式；兩者在正常老年人和Alzheimer ?。?AD） 腦脊液中 均存在， Aβ 42與 AD 老年斑形成密切相關(guān)。 6}、已具備 激光捕獲顯微分離技術(shù)和設(shè)備。 3）、實驗室現(xiàn)有的主要實驗儀器： （ 1）、病理制片配套設(shè)備 （ 2）、石蠟、冷凍、恒冷、超薄切片機 （ 3）、顯微像系統(tǒng) （ 4）、熒光、相差、倒置、自動照相顯微鏡 （ 5）、細(xì)胞培養(yǎng)全套設(shè)備 （ 6）、熒光分光光度計和紫外分光光度計 （ 7）、 PCR 儀、電泳儀 （ 8）、低溫超速離心機 （ 9）、超低溫冰箱 （ 10）、流式細(xì)胞儀 （ 11）、石英三蒸水發(fā)生器 （ 12）、三維細(xì)胞培養(yǎng)器 （ 13）、分子生物學(xué)實驗常用設(shè)備 （ 14）、動物實驗監(jiān)測維持設(shè)備 4）、骨形態(tài)計量學(xué)涉及的圖像分析系統(tǒng)已具備。 （二）研究基礎(chǔ)與工作條件 工作條件 1）、配有相應(yīng)的種植儀器和種植材料，動物實驗技術(shù)成熟 , 加力裝置已具備。 6）、通過體內(nèi)試驗，明確無負(fù)荷、生理負(fù)荷和超負(fù)荷狀況下，骨組織基因表達(dá)的差異。 4）、探尋新的未知的與骨形成或骨破壞密切相關(guān)的基因，為進(jìn)一步的深入研究提供新的線索。 2）、生理負(fù)荷和超負(fù)荷下成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的生物學(xué)性狀。 預(yù)期研究成果 成果以論文形式發(fā)表并組織鑒定。 完成研究方法技術(shù)路線中的第四部分：即采用半定量RTPCR 檢測不同負(fù)荷下表達(dá)差異明顯的基因。 完成研究方法技術(shù)路線中的第二部分，即體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞在間斷力學(xué)刺激下基因表達(dá)譜的基因芯片分析。 年度研究計劃及預(yù)期研究結(jié)果。 B）、若體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)的特異性基因表達(dá)是體外細(xì)胞水平實驗中沒有出現(xiàn)的，則很有可能是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞耦聯(lián)的作用方式，可為進(jìn)一步研究兩者相互作用方式提供實驗基礎(chǔ)。 4）通過本課題的研究可能引出的思考： A）不同類型的應(yīng)力，不同的作用方式和時間均有可能 影響基因的表達(dá)，本課題為簡化實驗，突出重點，選用間斷力學(xué)刺激作為力的作用形式。 2）首次應(yīng)用基因芯片技術(shù)從整個基因組的宏觀水平，探尋不同負(fù)荷狀態(tài)下，骨形成和骨破壞的基因調(diào)控機制，以及成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在其中的作用，及其可能的耦聯(lián)機制。 本項目的特色與創(chuàng)新之處。 與課題相關(guān)的基因芯片檢測技術(shù)比較成熟，課題組成員有一定的工作經(jīng)驗和技術(shù)，已同生物科技有限公司，生物芯片有限公司達(dá)成協(xié)議，基因芯片的制備和相關(guān)技術(shù)支持可以得到保證。 項目申請者多年從事生物力學(xué)、分子生物學(xué)的相關(guān)的研究，在臨床和科研 上有著多年的組織和實踐經(jīng)驗。反之亦然。 本項目在技術(shù)思想上是課題“？？？”的延續(xù)和發(fā)展。 骨界面 OB、 OC 基因表達(dá)譜的時序變化 骨界面 OB、 OC 基因表達(dá)譜的時序變化 研究骨形成到骨吸收質(zhì)的變化過程中， OB、 OC 基因調(diào)控機理。 五）、統(tǒng)計學(xué)分析處理 統(tǒng)計學(xué)分析各項實驗結(jié)果，明確間斷壓力下的骨形成和骨破壞過程中，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)和時序變化，通過體內(nèi)外實驗的對比，探討成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在間斷力學(xué)刺激下的耦聯(lián)機制。 2）、據(jù)基因芯片檢測的結(jié)果，對 I、 II 組基因表達(dá)差異最大的數(shù)個基因通過逆轉(zhuǎn)錄 聚合酶鏈反應(yīng)（ RTPCR）法，抽提細(xì)胞的總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄，再通過隨機引物法對此類基因進(jìn)行基因表達(dá)水平的半定量分析。 四）、 采用 RTPCR 檢測不同負(fù)荷下 表達(dá)差異明顯的基因 擬對在骨形成和骨吸收中基因表達(dá)差異（上調(diào)或下調(diào)）超過 5 倍的基因，應(yīng)用RTPCR 法進(jìn)行基因表達(dá)水平的半定量測定，并結(jié)合基因數(shù)據(jù)庫分析此生理過程中涉及功能性基因的種類和變化的幅度，以期闡明“標(biāo)記”基因。 3）、 II 組：按“超”負(fù)荷力值加載后，隨機選 5 只大鼠，分成 6 小組，分別在1h 加載后，以及 24h， 48h,6d 加載（ 每天 3 次，每次 1 小時）后 取下大鼠股骨，其余方法同 I 組。 三）、體內(nèi) 骨組織不同負(fù)荷和時間下成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞基因表達(dá)譜基因芯片檢測 1）、 90 只 SD 大鼠動物模型，隨機分為三組，每組各 30 只。 3）、將“生理”負(fù)荷和“超”負(fù)荷作用于成骨細(xì)胞，以 1h ,24h ， 48 h， 4d 為取樣點，未加力為對照，抽提 mRNA 后，逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記 cDNA ，應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測成骨細(xì)胞基因表達(dá)譜的時序變化。 二）、 體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞在間斷力學(xué)刺激下基因表達(dá)譜的基因芯片檢測 1）、體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，觀察不同負(fù)荷下的生物學(xué)性狀。 3）、 3 周后取材， 通過骨形態(tài)學(xué)計量方法分別檢測各種植體周圍骨質(zhì)的骨小梁表面成骨細(xì)胞數(shù)、骨小梁表面破骨細(xì)胞數(shù)、有成骨細(xì)胞被覆的類骨質(zhì)表面占骨小梁總表面的百分比、骨小梁吸收表面占骨小梁總表面的百分比等相關(guān)指標(biāo)檢測。 2）、隨機分為 5 組， Zwick1454 自動材料萬能試驗機分別以 0N， 5N， 10N， 20N，40N 力值、 2HZ 的頻率給種植體軸向加載，每天 3 次，每次 1 小時，連續(xù) 3 周。 擬采取的研究方案及可行性分析。 4）、通過探索骨形成和骨破壞過程中 OB 和 OC 特異性基因表達(dá)的種類和豐度，嘗試找尋相應(yīng)的“標(biāo)記”基因。 2）、通過體內(nèi)體外 OB 和 OC，在間斷力學(xué)刺激下 不同時間點取樣的基因表達(dá)譜的比較，研究骨系細(xì)胞基因表達(dá)的時序變化。 研究目標(biāo)： 本研究擬通過體內(nèi)外實驗，探討從骨形成到骨破壞這個質(zhì)的變化過程中骨系細(xì)胞基因表達(dá)的差異，從整體角度分析“生理”負(fù)荷促進(jìn)骨形成和“超”負(fù)荷導(dǎo)致骨破壞的基因調(diào)控機制，明確相關(guān)的特異性基因表達(dá)，探討 OB 和 OC 在力學(xué)刺激下的耦聯(lián)機制，探索未知的相關(guān)調(diào)控基因或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因，從而為與骨生物力學(xué)相關(guān)的臨床學(xué)科提供分子水平的理論基礎(chǔ)以及臨床應(yīng)用的指導(dǎo)。 第四部分：采用 RTPCR 方法，對骨形成和骨破壞過程中 OB、 OC 基因表達(dá)變化差異最 大的幾個基因進(jìn)行檢測和驗證。 第二部分：體外培養(yǎng) OB 和 OC，采用基因芯片法檢測不同力值的間斷力學(xué)刺激下OB 和 OC 基因表達(dá)譜的時序變化。313(1):1049. 項目的研究內(nèi)容、研究目標(biāo) ,以及擬解決的關(guān)鍵問題。17(12):210618. 1 Schena D. Davis R W. Brown P Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science,1995,270(20):467470. 1 Qackenbush J. Genomics Microarraysguilt by association science,20xx, 302(5643):24955. 1 Yim SH, Ward JM, Dragan Y, et analysis using amplified mRNA from