專題三核酸電泳技術(shù)-在線瀏覽
2025-07-12 22:20本頁面
【正文】 ， 主要是區(qū)分未處理的環(huán)狀 DNA樣品和單一位點經(jīng)限制酶作用線狀化的同一 DNA樣品 。 因此線狀 DNA染料復合物在凝膠中的遷移率約降低 15％ 。 電場強度升高時 ， 高分子質(zhì)量片段的遷移率遂不成比例的增加 。 要獲得大于 2kbDNA片段的良好分辨率 ， 則所用電壓不應高于 5～ 8V／ cm。 缺乏離子 (如用水替代電泳槽及凝膠中的緩沖液 )則電導率降至很低 ， DNA不是全然不動 ， 就是遷移極慢 。 最嚴重時凝膠會熔化 ， DNA會變性 。 這兩種瓊脂糖的凝點和熔點有所不同 ， 但是在實際應用中每種來源的瓊脂糖都可以用于分析或分離 125kb范圍的 DNA片段 。 這種凝膠用于電泳能方便地分離高分子質(zhì)量 DNA(直到 60kb)。 這一增加在百萬堿基大小 DNA的 PFGE中將明顯地節(jié)省時間 。 低熔點／凝點瓊脂糖主要用于 DNA的快速回收 ， 因為大多數(shù)該類型瓊脂糖在 65℃ 熔化 ， 這個溫度遠低于雙鏈 DNA的解鏈溫度 。 化學修飾的瓊脂糖比等濃度的標準瓊脂糖有更高的篩分能力 。 現(xiàn)在它能分辨少至 4bp的 DNA和分離 200800bp范圍內(nèi)相差 2％ 的 DNA片段 。 ? 溴酚藍在瓊脂糖凝膠中遷移速率是二甲苯氰 FF的 ，這一特性與瓊脂糖濃度無關(guān)。上述關(guān)系在濃度范圍 ％～ ％的瓊脂糖凝膠中基本不受濃度變化的影響。 DNA大小標準品 ? 通常使用已知分子質(zhì)量的 DNA樣品 ， 它們是經(jīng)限制性酶消化已知序列的質(zhì)?；蚴删w DNA獲得的 。 一般最好有兩套分子質(zhì)量范圍的標準 ， 一個是 1kb到大于 20kb的高分子質(zhì)量標準 ， 一個是 1001000bp的低分子質(zhì)量標準 。 溴化乙錠 ? 溴化乙錠首先于 20世紀 50年代合成成功 ， 主要是作為一種有效的殺錐蟲制劑而發(fā)展起來的菲啶化合物 。 它的殺錐蟲效能是其母化合物的 10～ 50倍 ， 并對小鼠無毒 ， 且與早期的菲啶化合物不同 ， 對牛不具有光致敏作用 。 溴化乙錠與核酸結(jié)合 ? 溴化乙錠包含一個平面的三環(huán)菲啶環(huán) ， 它能插入到雙鏈 DNA堆疊的堿基對之間 。 盡管其平面三環(huán)結(jié)構(gòu)被包埋 ， 其外圍苯基及乙基基團卻伸出插入到 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的大溝中 。 除沿螺旋縱軸方向發(fā)生 移外 ， 堿基對的幾何結(jié)構(gòu)和位置相對于螺旋結(jié)構(gòu)并未發(fā)生改變 。 ? 溴化乙錠也同樣可以通過不同的化學作用方式與 RNA以及熱變性或單鏈 DNA鏈內(nèi)堿基對所形成的螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)相結(jié)合 。 254 nm的紫外線首先被 DNA吸收 ，然后被傳送到染料；而 302nm以及 366 nm的射線直接被染料自行吸收 。 ? 大部分商品化的紫外線光源產(chǎn)生 302 nm的紫外線 。 然而 ， 302 nm紫外線所造成染料的光褪色效應以及造成 DNA的斷裂和缺口明顯要較 254nm紫外線少得多 。 盡管加入溴化乙錠會導致線性雙鏈 DNA的電泳遷移率減慢～ 15％ ， 但卻可在紫外燈下直接檢查凝膠 。 ? 當需要知道 DNA片段的準確大小 (如 DNA限制酶酶切圖譜的鑒定 )， 凝膠應該在無 EB情況下電泳 ， 電泳結(jié)束后用 EB
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