【正文】 的研究概況 ?????????????????????? ? ????? 1 硼的 研究概況 ?????????????????????????? ? ?? 2 鉬的 研究概況 ???????????????????????? ?? ? ? ? 3 2 材料與方法????????????????????????? ?? ???? 3 材料??????????????????? ????? ?? ? ??? ? ?? 4 方法????????????????? ??????? ?? ? ?????? 4 3 結(jié)果與分析???????????????????????????? ? ? 6 硼和鉬對(duì)鹽藻生長(zhǎng)的調(diào)控????????????????? ? ??? ??? 6 硼和 鉬對(duì)培養(yǎng)液中 β胡蘿卜素 積累的調(diào)控????? ???? ???????? 7 硼和 鉬對(duì) 中細(xì)胞 β胡蘿卜素 積累的調(diào)控????????????? ??? ? ? 8 硼和鉬對(duì)培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)積累的調(diào)控??????????? ? ? ?????? 9 硼和鉬對(duì)細(xì)胞中蛋白質(zhì)積累的調(diào)控 ??????????????????? 10 4 討論 ??????????????????????????? ?? ???? 11 結(jié)論????????????????????????? ??? ?????? 13 致謝?????????????????????? ?? ?????? ? ??? 14 參考文獻(xiàn)????????????????????????? ??? ???? 15 附錄 A??????????????????????? ???? ?????? 17 附錄 B????????????????????????? ???? ???? 18 淮海工學(xué)院二○○七屆畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 1 頁(yè) 共 19 頁(yè) 1 引言 鹽藻 ,即杜氏藻 ( Dunaliella salina),為單細(xì)胞藻類(lèi) ,外包一層膠鞘 ,無(wú)細(xì)胞壁 ,是綠藻門(mén)、團(tuán)藻目、多鞭毛科的一個(gè)屬 ,約 30 個(gè)種 ,其中最具代表性和應(yīng)用最廣的是鹽生杜氏藻。藻體內(nèi)有一環(huán)狀的葉綠體 ,內(nèi)含一淀粉核 。有性生殖為同配結(jié)合。因細(xì)胞內(nèi)常含有大量的胡蘿卜素而使其個(gè)體呈橘紅色 。 鹽生桿氏藻體內(nèi)含 β 胡蘿卜素的量可達(dá)其干重的 10 %左右 ,并富含甘油、蛋白質(zhì)、脂肪酸、葉綠素和四烯酸 ,具有營(yíng)養(yǎng)保健作用 ,是一種經(jīng)濟(jì)藻類(lèi)和新型的“農(nóng)作物” [1]。 隨著人們對(duì) β胡蘿卜素功效的認(rèn)識(shí)日益深入，對(duì)有關(guān)鹽藻累積 β胡蘿卜素的研究也逐 步加深。但是化學(xué)合成的 β胡蘿卜素不可避免地帶有副產(chǎn)物。而且人工合成的 β胡蘿卜素中， β胡蘿卜素順式異構(gòu)體的含量少，只占約20%左右。篩選出的鹽藻 β胡蘿卜素高產(chǎn)品系在高溫、高鹽、強(qiáng)光照和缺氮的條件下 ， 累積的 β胡蘿卜素占千重的 10%以上，有報(bào)道最高可達(dá) 14％ ；而在一般的生物體中僅占千重的 %左右。 因此 ,以生產(chǎn)胡蘿卜素為目的的鹽藻培養(yǎng)在國(guó)際上受到重視。且在醫(yī)學(xué)上的其他方面也 有重要應(yīng)用 。 國(guó)外對(duì)這類(lèi)藻的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)做了大量研究 [2] , 國(guó)內(nèi)近年也在其地理分布 [3] 、細(xì)胞和分子鑒定 [4][5][6][7 ] 、基因工程 [8][9 ] 、活性物質(zhì)分析 [11][12] 、環(huán)境因子對(duì)其生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累以及培養(yǎng)采收技術(shù)等方面 [13]開(kāi)展了廣泛的研究。目前 ， 在澳大利亞西部的 Whyalla，養(yǎng)殖鹽藻達(dá) 300公頃，收獲鹽藻的設(shè)備每小時(shí)可處理藻液 1000噸。我國(guó)的海南島也有小規(guī)模試養(yǎng)。我國(guó)雖然 1982 年在西藏扎淮海工學(xué)院二○○七屆畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 2 頁(yè) 共 19 頁(yè) 布耶鹽湖首次發(fā)現(xiàn)了富含胡蘿卜素且嗜寒性?xún)?yōu)良的扎布耶鹽藻 ,但因研究力量薄弱 ,未能進(jìn)一步引種推廣。近年來(lái)隨著科研工作的深入 ,內(nèi)蒙古、海南等地的鹽藻培養(yǎng)工廠(chǎng)均已陸續(xù)投產(chǎn) ,標(biāo)志著我國(guó)鹽藻培養(yǎng)與開(kāi)發(fā)利用正在向國(guó)際先進(jìn)水平發(fā)展。硼在植物體內(nèi)的含量通常為 2～ 100 mg／ kg，小于 10 mg／ kg時(shí)則引起植物缺硼，大多數(shù)植物出現(xiàn)缺硼癥狀 [14]。而果膠網(wǎng)絡(luò)是構(gòu)成完整細(xì)胞壁必不可少的組成成分之一。缺硼能使向日葵嫩芽中的細(xì)胞壁微纖維排列不正常 [16]。缺硼導(dǎo)致病害癥狀的出現(xiàn)因不同植物而異。 硼與細(xì)胞壁組分間發(fā)生反應(yīng)生成多羥基化合物增強(qiáng)細(xì)胞壁的穩(wěn)定性和良好的結(jié)構(gòu)。硼的直接作用與花藥的花粉產(chǎn)生能力以及花粉粒生活力有密切關(guān)系?；ㄊ侵参矬w含硼量最高的部位，尤其是柱頭和子房。硼促進(jìn)生殖器官的發(fā)育。硼能改變植物激素活性，參與保護(hù)吲哚乙酸氧化酶系統(tǒng)，促進(jìn)生長(zhǎng)素運(yùn)轉(zhuǎn)。生長(zhǎng)素和硼之間有明顯的相互作用。在吲哚乙酸的刺激作用下，根伸長(zhǎng)正常。因此一般對(duì)硼的需求也僅限于維管植物。莖形成層組織細(xì)胞分裂加強(qiáng)，形成層 細(xì)胞增生。硼能與酚類(lèi)化合物絡(luò)合，克服酚類(lèi)化合物對(duì)吲哚乙酸氧化酶的抑制作用。 硼在碳水化合物代謝中有兩方面的功能：細(xì)胞壁物質(zhì)的合成和糖運(yùn)輸。硼影響 RNA，尤其是尿嘧啶的合成。硼能增強(qiáng)細(xì)胞壁對(duì)水分的控制，從而增強(qiáng)植物的抗寒和抗病能力?；春９W(xué)院二○○七屆畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 3 頁(yè) 共 19 頁(yè) 硼不易從衰老組織向活躍生長(zhǎng)組織移動(dòng)，最先出現(xiàn)缺硼的是頂芽停止生長(zhǎng)。硼不足時(shí)根端、莖端生長(zhǎng)停止，嚴(yán)重時(shí)生長(zhǎng)點(diǎn)壞死，側(cè)芽、側(cè)根萌發(fā)生長(zhǎng)，枝葉叢生。 鉬的 研究概況 植物對(duì)鉬的需要量低于任何其它礦質(zhì)元素。 鉬是硝酸還原酶的必需部分，參與硝態(tài)氮還原為銨的過(guò)程。根中也分離出這種物質(zhì)。硝酸還原酶是一種復(fù)合酶，含有血紅素鐵和兩個(gè)鉬原子，存在于高等植物細(xì)胞質(zhì)中，需要 NADP+/NADPH 作為電子受體。 鉬是固氮酶的結(jié)構(gòu)組分，該酶參與豆科作物根瘤固氮菌、一些藻類(lèi)、放線(xiàn)菌、自生固氮生物的固氮作用。缺鉬可引起豆科作物缺氮。固氮酶由鐵鉬蛋白和鐵蛋白組成。固氮過(guò)程中，首先是鐵蛋白接受 1個(gè)電子，傳遞至鎂 ATP，形成鐵蛋白 .鎂 ATP復(fù)合體，降低氧化還原電位；然后與鐵鉬蛋白結(jié)合形成鐵蛋白 ?鎂 ATP鐵鉬蛋白復(fù)合體，固定游離氮分子。 缺鉬使固氮酶和硝酸還原酶活性降低 [18]，葉綠體的結(jié)構(gòu)受損，葉綠素含量減少 [19]，碳代謝異常，碳水化合物的合成受阻 [20]。還有報(bào)道說(shuō)，鉬在植物對(duì)鐵的 吸收和運(yùn)輸中起著不可替代的作用。 植物缺鉬癥有兩種類(lèi)型，一種是葉片脈間失綠，甚至變黃，易出現(xiàn)斑點(diǎn)，新葉出現(xiàn)癥狀較遲。一般表現(xiàn)葉片出現(xiàn)黃色或橙黃色大小不一的斑點(diǎn)，葉緣向上卷曲呈杯狀。不同作物的癥狀有差別。一般癥狀先在老葉上出現(xiàn)。 2 材料與方法 材料 基本 材料 鹽藻 (Dunaliella)由中國(guó)海洋大學(xué)提供，實(shí)驗(yàn)前經(jīng)擴(kuò)繁并培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期備用。 藥品 氯化鉀 KCl 南京化學(xué)試劑廠(chǎng) 氯化鈣 CaCl2 天津市塘沽濱?；S(chǎng) 氯化鈉 NaCl2 南京化學(xué)試劑有限公司 氯化錳 MnCl2 7H2O 江蘇徐州試劑二廠(chǎng) 硫酸鋅 ZnSO4 4H2O 天津市化學(xué)試劑四廠(chǎng) 乙二胺四乙酸二鈉 Na2EDTA 南京化學(xué)試劑一廠(chǎng) 方法 實(shí)驗(yàn)處理 （ 1） 取母液 1（ NaNO3： 5g／ L； KH2PO4： lg／ L； KC1： 7g／ L； MgSO4： 10g／ L；CaCl2： 1g／ L） 180ml 加水稀釋至 1000ml。 7H2O： 3g／ L） 36ml，混合 母液 1 母液2。 4H2O mg， ZnSO4 淮海工學(xué)院二○○七屆畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 5 頁(yè) 共 19 頁(yè) （ 4） 取備用藻液用離心機(jī)離心 5 分鐘 （ 4000rmp） ,取適量藻泥加入混好的溶液中 使藻液吸光度 A450=（略?。?，然后把藻液分別裝在 27 個(gè) 100ml 的三角瓶中，貼上標(biāo)簽，每瓶 50ml。 4H20，使其濃度分別為： A瓶 Mo 40μ g/L、 B 2mg/L。 C瓶 Mo 40μ g/L、 B 6mg/L。 E瓶 Mo 60μ g/L、 B 4mg/L。 G瓶 Mo 80μ g/L、 B 2mg/L。 I瓶 Mo 80μ g/L、 B 6mg/L 使瓶有溶液 60 ml，每組重復(fù) 3 個(gè)。 藻液的培養(yǎng) 把配制好的藻液放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度白天為 25℃ ，夜間 20℃ ， 光照與黑暗的比為 12h： 12h， 白天光照強(qiáng)度 3500Lx，每天早晚各搖瓶一次并轉(zhuǎn)換瓶體位置。 鹽藻細(xì)胞生長(zhǎng)的測(cè)定 培養(yǎng)液中鹽藻細(xì)胞密度統(tǒng)計(jì)采用血球計(jì)數(shù)板法。鹽藻細(xì)胞密度單位采用 “ x107cells 藻液中細(xì)胞密度的計(jì)算 公式： Y(x107cells/mL)=（ 943X61） x104 Y藻液中鹽藻細(xì)胞密度 (x107cells/mL)； X藻液吸光度 A450 鹽藻β 胡蘿卜素含量的測(cè)定 取 5mL 藻液，離心 （ 4000rmp,20min） 棄上清，加入適量 90%丙酮溶液提取色素，重復(fù) 2 次，合并各次提取液，定容到 10mL，于分光光度計(jì)波長(zhǎng) 450nm 處讀取 A450。cell1） =P106/N P： β胡蘿卜素含量 (mg/L)； N： 細(xì)胞密度 (x107cells 蛋白質(zhì)含量的 測(cè)定采用紫外吸收法，將蛋白質(zhì)的提取液置于 1cm的石英比色杯中，以蒸餾水為對(duì)照，于分光光度計(jì)波長(zhǎng) 280nm 和 260nm 處分別讀取 A280和 A260。mL1） =－ 單個(gè)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量 （ pgmL1)； N： 細(xì)胞密度 (107cells 140 60 80Mo濃度:μg/L細(xì)胞密度(x107cells?mL1)B 2mg/LB 4mg/LB 6mg/L 圖 1 硼和鉬對(duì)鹽藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 各組藻液密度的 數(shù)據(jù)經(jīng) SPSS 軟件單因素處理得 F= (8,18)=,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異極顯著 ， 每組數(shù)據(jù)經(jīng)兩兩比較后得到表 1。 鉬的濃度為40μ g/L和 80μ g/L時(shí) ， 鹽藻的細(xì)胞密度在 硼 濃度 為 4mg/L 時(shí) 明顯大于硼 為 2mg/L 和 6mg/L時(shí)的細(xì)胞密度 。 當(dāng)硼元素的濃度為 2mg/L 時(shí)，鉬元素密度 在 40μ g /L、 60μ g /L 和 80μ g /L 時(shí)，鹽藻細(xì)胞密度 差異不 大 ，這可能是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的誤差造成的； 當(dāng)硼元素的濃度為 4mg/L 時(shí) , 鹽藻的細(xì)胞密度在鉬為 40μ g/L 和 80μ g/