【正文】 備等高增長(zhǎng)、高帶動(dòng)的產(chǎn)業(yè)，將可以在較短的時(shí)間內(nèi)建立起產(chǎn)業(yè)規(guī)模和競(jìng)爭(zhēng)能力。同時(shí)促進(jìn)國(guó)內(nèi)生物技術(shù)創(chuàng)新性藥物的研究開發(fā)，加快生物工程藥物產(chǎn)業(yè)化，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)優(yōu)化調(diào)整。 3. 項(xiàng)目具體內(nèi)容及研究方案 . 重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ rhbFGF）產(chǎn)業(yè)化主要研究?jī)?nèi)容、擬解決的技術(shù)難點(diǎn) bFGF 是一種多功能細(xì)胞生長(zhǎng)因子，能刺激中胚層和神經(jīng)外胚層來(lái)源細(xì)胞的增殖，并具有促進(jìn)修復(fù)和再生的作用。本項(xiàng)目來(lái)源于國(guó)家 863 計(jì)劃，已經(jīng) 完成臨床和中試，并獲得國(guó)家一類新藥證書及藥品生產(chǎn)文號(hào)，生產(chǎn)技術(shù)與工藝比較成熟，產(chǎn)業(yè)化研究的內(nèi)容主要是大規(guī)模生產(chǎn)的工藝穩(wěn)定性、成本控制、質(zhì)量控制，重點(diǎn)需解決的問(wèn)題如下： . 重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ rhbFGF）與其他細(xì)胞生長(zhǎng)因子相比，發(fā)酵條件比較難以控制，常因 pH值等變化導(dǎo)致細(xì)菌不生長(zhǎng)或無(wú)表達(dá)，本項(xiàng)目的重點(diǎn)工作之一是摸索大規(guī)模發(fā)酵的條件，如細(xì)菌接種量、溶氧、攪拌轉(zhuǎn)速等工藝參數(shù)，建立細(xì)菌 OD 值、誘導(dǎo)時(shí)間與目的蛋白表達(dá)量的關(guān)系曲線，確定最優(yōu)發(fā)酵的條件。 . 重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ rhbFGF）的活性受溫度和水分含量的影響較大，因此，在凍干過(guò)程中重點(diǎn)需要考察不同溫度與凍干時(shí)間對(duì)水分含量與活性的影響，以選擇最適當(dāng)?shù)臏囟群蛢龈蓵r(shí)間，使凍干粉的水分含量低于 3%， 第 15 頁(yè) 共 53 頁(yè) 且活性受到的影響降到最低。 . 重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ rhbFGF）系列制劑的研究?jī)?nèi)容、擬解決的技術(shù)難點(diǎn) 由于重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ rhbFGF）是多功能刺激因子，對(duì)與創(chuàng)傷修復(fù)有關(guān)治病有廣泛治療作用，但由于其生物活性受多種因素的影響而不穩(wěn)定。 . 重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ rhbFGF）凝膠劑的研究?jī)?nèi)容、擬解決的技術(shù)難點(diǎn) 凝膠劑是近幾年局部外用制劑研發(fā)的熱點(diǎn)， 凝膠劑作為新的藥物劑型在臨床上應(yīng)用已經(jīng)得到肯定，但由于技術(shù)原因蛋白質(zhì)類凝膠劑并不多見， 重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ rhbFGF）凝膠劑 尚未上市。 . 凝膠劑 300 例 Ⅲ 期臨床試驗(yàn)，重點(diǎn)與凍干粉比較觀察對(duì)新鮮創(chuàng)面的療效。 . 脂質(zhì)體凝 膠劑的制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制，凝膠劑的生產(chǎn)工藝，樣品的制備和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的控制，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。 . 技術(shù)創(chuàng)新點(diǎn) . 凝膠劑加入可與 bFGF 特異結(jié)合的肝素，以增強(qiáng) bFGF 與受體的結(jié)合能力，并增強(qiáng)對(duì)酸、堿、熱等因素的抗性，加入肝素后，生物學(xué)活性提高至少 2倍，提高了產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 . 脂質(zhì)體主要由天然磷脂和膽固醇組成，進(jìn)入體內(nèi)后可被生物降解，不會(huì)積累在體內(nèi)，且免疫原性小。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞和融合作用，脂質(zhì)體可直接將藥物送入細(xì)胞內(nèi)，避免使用高濃度游離藥物。 . 擬解決的技術(shù)難點(diǎn) . 重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ rhbFGF）與肝素的結(jié)合比例將影響到其生物活性，因此，通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索其與肝素結(jié)合的最佳比例將成為該劑型開發(fā)的重點(diǎn)工作之一。 因此，脂質(zhì)體包埋技術(shù)將是該劑型開發(fā)的另一重點(diǎn)難點(diǎn)技術(shù)。 . 已經(jīng)獲得了臨床批件，已經(jīng)完成了Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn)，目前正在進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗(yàn)。重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ rhbFGF）作用于眼表病變 部位，可激活調(diào)控與修復(fù)有關(guān)細(xì)胞的增殖、移行，促進(jìn)細(xì)胞代謝、改善營(yíng)養(yǎng)，主動(dòng)促進(jìn)修復(fù)，加速愈合。 . 滴眼液的制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制： 通過(guò)試驗(yàn)確定常規(guī)制備方法是否能滿足滴眼劑外觀形狀的要求；采用澄明度檢測(cè)儀檢測(cè)澄明度，并進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)；參照凍干粉劑的檢定規(guī)程，摸索滴眼劑的活性測(cè)定方法。 . 擬解決的技術(shù)難點(diǎn) . 重組人堿性成纖維細(xì) 胞生長(zhǎng)因子（ rhbFGF）是不穩(wěn)定的活性多肽，需 第 18 頁(yè) 共 53 頁(yè) 要通過(guò)大量的結(jié)構(gòu)和功能研究確定突變點(diǎn)，構(gòu)建一株高效表達(dá)的工程菌。 . 重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ rhbFGF）外用溶液的研究?jī)?nèi)容、擬解決的技術(shù)難點(diǎn) . 主要研究?jī)?nèi)容 . 外用溶液的處方： 采用 MTT 法分別考察所用輔料、試劑對(duì) rhbFGF 的穩(wěn)定性和生物活性的影響；采用正交及均勻設(shè)計(jì)考察藥效成分與輔料之間的協(xié)同性研究。 . 外用溶液臨床前研究： 根據(jù)現(xiàn)行的藥品注冊(cè)管理辦法，可免做藥理毒理實(shí)驗(yàn)，需按要求整理相關(guān)資料。 . 重點(diǎn)解決的技術(shù)關(guān)鍵問(wèn)題 . 重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ rhbFGF）新劑型開發(fā)中若保護(hù)劑選擇不當(dāng)，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)主藥活性喪失或無(wú)法檢測(cè)或刺激性大等問(wèn)題，所以蛋白活性保護(hù)、檢測(cè)方法靈敏度與特異性問(wèn)題尚需優(yōu)化。 . 重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ rhbFGF）是不穩(wěn)定蛋白，生產(chǎn)制備過(guò)程中若操作不當(dāng)或保護(hù)劑選擇不當(dāng)，易出現(xiàn)聚合、 N 端降解、活性喪失等問(wèn)題，從而導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不合格，所以制備過(guò)程中重點(diǎn)提高蛋白穩(wěn)定性，并進(jìn)行 第 19 頁(yè) 共 53 頁(yè) 長(zhǎng)期穩(wěn)定性的考察。 4. 項(xiàng)目的技術(shù)特色和水平 . 成果來(lái)源及知識(shí)產(chǎn)權(quán)情況 重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子是國(guó)家一類新藥，由北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司和暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研發(fā)中心共同研制，并取得多項(xiàng)國(guó)家專利和國(guó)際專利。 南海朗肽制藥有限公司在取得重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子技術(shù)之后，于 2020 年建立中試車間，進(jìn)行外用重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子凍干制劑的生產(chǎn)和銷售。同時(shí)，在實(shí)現(xiàn)外用重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子產(chǎn)業(yè)化的過(guò)程中，以外用重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子為核心，研究開發(fā) 出一系列的新劑型，為本項(xiàng)目的后續(xù)發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 . 國(guó)外技術(shù)現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì) 1940 年， Hoffman 等在牛腦垂體提取物中發(fā)現(xiàn)一種能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)， 70 年代部分純化這些提取物，發(fā)現(xiàn)它是成纖維細(xì)胞的一種有絲分裂 第 20 頁(yè) 共 53 頁(yè) 原 (mitogen)， 1975 年定名為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ Fibroblast growth factor ，F(xiàn)GF），并初步確定了它的理化性質(zhì)。 1985 年 Esch， 1986 年 GimenezGallego 分別確定堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ bFGF）和酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ aFGF）的氨基酸順序。 Abraham 等人在 1986 年獲得 bFGF 的 cDNA 克隆，從此 bFGF 的研究進(jìn)入分子生物學(xué)階段。 bFGF 對(duì)血管的形成、分化具有重要的誘導(dǎo)作用，因此它又可開發(fā)為保健品添加劑。 . 國(guó)內(nèi)技術(shù)現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì) 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子作為一種創(chuàng)面修復(fù) 的較理想的藥物，在國(guó)內(nèi)已經(jīng)被批準(zhǔn)上市銷售。局部外用未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用，對(duì)人體各器官系統(tǒng)功能無(wú)損害。 第 21 頁(yè) 共 53 頁(yè) 第二代外用重組人 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 凍干制劑在南海朗肽制藥公司和北京雙鷺制藥公司進(jìn)行生產(chǎn)。 （ 2） 采用大腸桿菌溫控表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)，與第一代采用 IPTG 誘導(dǎo)型表達(dá)載體相比，大大降低了生產(chǎn)成本，具有極強(qiáng)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。 . 項(xiàng)目技術(shù)特點(diǎn)以及與現(xiàn)有技術(shù)或 工藝比較具有的優(yōu)勢(shì)： . 基因來(lái)源于東方人血紅細(xì)胞，采用 RTPCR 方法直接克隆人的 bFGF 基因。 . 重組蛋白是人源化的基因表達(dá)產(chǎn)物，與人體 100%同源，應(yīng)用于人體具有免疫原性和致敏性低等優(yōu)點(diǎn)。 . 對(duì)瘢痕形成影響不同 常規(guī)藥物治療創(chuàng)傷、潰瘍由于是抗感染被動(dòng)修復(fù)過(guò)程，因而容易留下瘢痕和色素沉著；而重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子質(zhì)量創(chuàng)傷、潰瘍由于是主動(dòng)修復(fù)過(guò)程，愈合時(shí)間段，因而可有效減少瘢痕形成和色素沉著。 5. 項(xiàng)目的技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo) . 重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子產(chǎn)業(yè)化的主要技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)和水平 目的蛋白表達(dá)率將在 20~30%之間，產(chǎn)量可達(dá)每升培養(yǎng)物 80~100mg，目的蛋白收率可達(dá) 50%，純度≥ 98%，比活性≥ 1 106IU/mg；凍干收率達(dá) 95%以上，技術(shù)水平可達(dá)國(guó)內(nèi)先進(jìn)。 . 重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ rhbFGF）系列制劑的研究開發(fā)的主要技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)和水平 第 23 頁(yè) 共 53 頁(yè) . 建立重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子外用凝膠和滴眼液的穩(wěn)定生產(chǎn)工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 . 獲得重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子外用凝膠的生產(chǎn)批件。 . 開發(fā)出 10~20 個(gè)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ rhbFGF）美容化妝品。 . 2020 年 7 月至 2020 年 7 月，完成重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子凝膠劑的臨床試驗(yàn)。 . 2020 年 10 月至 2020 年 12 月，完成重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子滴眼液臨床前研究。 三、 項(xiàng)目技術(shù)路線 第 24 頁(yè) 共 53 頁(yè) 1. 技術(shù)總路線 從人血細(xì)胞提取 mRNA 反轉(zhuǎn)錄 PCR bFGF 基因 分子克隆技術(shù) 構(gòu)建基因工程菌株 發(fā)酵生產(chǎn) 分離純化 rhbFGF 原料 保護(hù)劑 rhbFGF 外用凝膠、外用溶液、滴眼液 真空凍干 rhbFGF 凍干制劑成品 2. 關(guān)鍵技術(shù)及創(chuàng)新點(diǎn)分析 . 重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ rhbFGF）產(chǎn)業(yè)化 重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ rhbFGF） 產(chǎn)業(yè)化需要解決的首要問(wèn)題是原料來(lái)源，本項(xiàng)目通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵工藝和純化工藝，使得目的蛋白重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)量大大提高至 100mg/L，已經(jīng)達(dá)到國(guó)內(nèi)外領(lǐng)先水平，保證了產(chǎn)業(yè)化及后續(xù)制劑開發(fā)的原料來(lái)源問(wèn)題；其次，通過(guò)優(yōu)化凍干工藝，使得重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子凍 干制劑的水分在 3%以下，既保證了重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的活性穩(wěn)定性，又保證了凍干粉的外觀形狀。 . 重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ rhbFGF） 外用 凝膠 的 關(guān)鍵技術(shù)和創(chuàng)新點(diǎn)分析 目前國(guó)內(nèi)外 rhbFGF 只有凍干制劑上市， rhbFGF 凝膠劑完成后將為臨床提供基于濕性愈合理論的新藥，與凍干制劑比，臨床使用頻率由每日使用、每日兩次該成隔日使用、每日一次，而且減少換藥粘連、 提高療效。 rhbFGF 凝膠劑處方中的卡波姆和透明質(zhì)酸的合理配比使其兼具緩釋和保濕功能 ； 凝膠劑加入可與 bFGF 特異結(jié)合的肝素，以增強(qiáng) bFGF 與受體的結(jié)合能力，并增強(qiáng)對(duì)酸、堿、熱等因素的抗性，加入肝素后，生物學(xué)活性提高至少 2倍，提高了產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) ； 脂質(zhì)體主要由天然磷脂和膽固醇組成，進(jìn)入體內(nèi)后可被生物降解，不會(huì)積累在體內(nèi)，且免疫 原性小。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞和融合作用，脂質(zhì)體可直接將藥物送入細(xì)胞內(nèi)，避免使用高濃度游離藥物 ； 凝膠劑作為脂質(zhì)體局部給藥的載體，可在脂質(zhì)體周圍形成一道屏障控制脂質(zhì)體中藥物釋放的速率，避免藥物的突釋效應(yīng)，同時(shí)凝膠劑手感細(xì)膩，易清洗。外用溶液是在加入可與 FGF 特異結(jié)合的肝素，以增強(qiáng) FGF 與受體的結(jié)合能力，并增強(qiáng)對(duì)酸、堿、熱等因素的抗性，同時(shí)，加入生物活性保護(hù)劑海藻糖，從而實(shí)現(xiàn) FGF 的液體保存狀態(tài)，減少了復(fù)溶過(guò)程可能的污染，成本更低，使用更安全。 . 重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ rhbFGF） 滴眼液 的 關(guān)鍵技術(shù)和創(chuàng)新點(diǎn)分析 眼表疾病是我國(guó)最主要和最 常見的致盲眼病之一，該病病因復(fù)雜，治療棘手，常因診治延誤導(dǎo)致愈合延遲或者不愈合，甚至致盲。 蛋白質(zhì) 類滴眼液的研制，關(guān)鍵是解決這類藥物的穩(wěn)定性問(wèn)題，在一定溶液條件下， rhbFGF 分子中 Met、 Cys、 His、 Trp 及 Tyr 的某些基團(tuán)與各種活潑氧具有很高的反應(yīng)性易受到氧化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的活性下降，容易發(fā)生水不溶性聚集而沉淀。 另外，本項(xiàng)目在國(guó)內(nèi)率先建立動(dòng)物角膜上皮激光損傷模型并建立定量評(píng)價(jià)角膜上皮恢復(fù)指標(biāo)： 角膜上皮損傷修復(fù)，難于進(jìn)行定量評(píng)價(jià)，因此很難科學(xué)評(píng)價(jià)一個(gè)藥物對(duì)角膜上皮細(xì)胞的修復(fù)程度。鑒于角膜損傷修復(fù)后透光率的大小間接反 第 27 頁(yè) 共 53 頁(yè) 應(yīng)角膜的修復(fù)情況，損傷修復(fù)后角膜上皮細(xì)胞數(shù)量反應(yīng)角膜細(xì)胞的再生水平，本項(xiàng)目藥效學(xué)評(píng)價(jià)中建立了三個(gè)科學(xué)可行的定量評(píng)價(jià)指標(biāo)：角膜透光率 OD 值，MTT 方法檢測(cè)角膜上 皮細(xì)胞數(shù)量，角膜損傷斑面積。能興集團(tuán)以房地產(chǎn)、商業(yè)、陶瓷等產(chǎn)業(yè)為主營(yíng)業(yè)務(wù)，是年納稅超億元的中國(guó) 500 強(qiáng)企業(yè)，暨南大學(xué)是具有百年歷史的嶺南名校，在生物工程、企業(yè)管理等領(lǐng)域具有傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)。截止至 2020 年 6 月 30 日，公司已生產(chǎn)外用重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 80 萬(wàn)支，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，成品一次檢驗(yàn)合格率達(dá)100%，原液一次檢驗(yàn)合格率為 99%，據(jù)正在進(jìn)行考察的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)顯示產(chǎn)品穩(wěn)定性良好。此生產(chǎn)基地包括生產(chǎn)車間 5000m2，質(zhì)檢研發(fā)中心 1000 m2，綜合樓 6000m2，及庫(kù)房與公用輔助用房 2200m2。 新生產(chǎn)基地 可進(jìn)行 多種 生 第 28 頁(yè) 共 53 頁(yè) 物原料的生產(chǎn)和多種劑型的制造，如凍干制劑，噴霧劑，凝膠劑，滴眼劑，膜劑 和小容量注射劑等，總產(chǎn)量可達(dá)年產(chǎn) 800 萬(wàn)支外用重組成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及相關(guān)系列產(chǎn)品。溫州醫(yī)學(xué)院通過(guò)近 10 年的銳意進(jìn)取，在生物制藥領(lǐng)域同樣具備了較為雄厚的研發(fā)實(shí)力，目前， 已建立了一個(gè)符合 GLP 要求的藥物開發(fā)研究室和符合 GMP 要求的藥物中試研究基地，總面積超過(guò)了 3000 平方米，設(shè)備總投資超過(guò)2020 萬(wàn)元，同時(shí)建有浙江省生物技術(shù)制藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、國(guó)家新藥開發(fā)工程研究中心制劑工程研究基地 、浙江省遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等科研