【正文】 、代謝物、能量代謝物質(zhì)等，如需了解藥物作用與前列腺素的關(guān)系，可觀察 PGl2或代謝產(chǎn)物的變化，以觀察藥物對的影響。 (4)血液流變性指標測定：阻斷冠狀動脈前后定時抽取血液，測定全血黏度、血漿纖維蛋白原含量、血細胞比容、紅細胞沉降率、血小板黏附和聚集性等血液流變學(xué)指標。 (2)正式實驗之前應(yīng)熟練掌握動物開胸手術(shù)和冠狀動脈分離手術(shù)，盡量減少出血，做心包床時，心肌不應(yīng)移位而影響心臟的正常舒縮功能。心外膜電極放置的位置，或反復(fù)測定的位置應(yīng)準確固定，不應(yīng)移位。否則將影響實驗的準確性。 (5)在進行本項實驗時一定要嚴格控制實驗條件，排除干擾因素，確保實驗結(jié)果。 (二 )大鼠實驗性心肌梗死模型 I，原理 結(jié)扎大鼠的冠狀動脈前降支，阻斷其分布區(qū)域的心肌供血，心肌細胞長時間缺血缺氧而造成不可逆損傷和壞死。剪開心包膜，暴露心臟，冠狀動脈左前降根部穿線以備結(jié)扎，記錄標準導(dǎo)聯(lián)心電圖，穩(wěn)定 10min，結(jié)扎冠狀動脈左前降支，關(guān)閉胸腔，用針筒或橡皮吸引吸出動物喉部分泌物，使動物恢復(fù)呼吸。 (2)測定血漿生化指標：如 IDH、 CPK、 ATP、 cAMP／ cGMP、 PGI2／TXA2等。可用石蚶包坤組織塊切片，染色，顯微鏡下觀測，分級定度或用定量組織學(xué)方法直接算心肌梗死面積。手術(shù)者必須熟悉冠狀動脈的分布和解削位置，便于定位。 (三 )心肌缺血再灌注損傷模型 1．原理 心肌經(jīng)一定時間缺血 (缺氧 )后，突然恢復(fù)血 (氧 )供，形成更嚴重損傷，即“心肌缺血再灌注損傷”，其形成原因可能是心肌恢復(fù)血流時，加速細胞膜內(nèi)外的鈉鈣交換，大量鈣離子進人細胞內(nèi)，形成“鈣超載”：心肌細胞發(fā)生“拘縮”而喪失功能。在藥效學(xué)研究可根據(jù)所試藥物的藥理作用及作用特點，選用不同的動物和模型。一般采用阻斷局部冠狀動脈血流一定時間，然后恢復(fù)冠脈血流，形成再灌注損傷。 (2)離體心臟缺血再灌注損傷模型：實驗一般用成年 Wistar種雄性大鼠，猛擊動物頭部使昏迷，快速開胸，摘取心臟、立即放人 4℃ 改良 KrebsHensleit液中，主動脈插管，裝于 Leaigendorff罐流裝置，以K— H液 (pH7． 4)恒溫 37℃ 進行灌流。 實驗程序：①預(yù)備灌流期，心臟正常灌流 (正常改良 K— H液 )，穩(wěn)定 l0min，給藥灌流 (含不同藥物的改良 KH液，實驗持續(xù)進行 )5min。③復(fù)灌期，剪斷結(jié)扎線，進行再灌注 15min。②心肌丙醛 (ADA)含量及越氧化物歧化酶 (s0D)活性，實驗結(jié)束后，剪下再灌區(qū)全層心肌約 0． 2g，制備勻漿進行測定。心肌梗死面積測定，實驗結(jié)束時，將心臟橫切染色，計算心肌梗死面積。心肌細胞缺氧缺糖后，功能從形態(tài)有明顯改變，如胞漿泡形成，胞漿顆粒增加出現(xiàn)異形心肌細胞等；經(jīng)活體染色證實細胞死亡數(shù)增加；搏動頻率下降，動作電位改變；胞漿的乳酸脫氫酶，羥酸脫氫酶及磷酸肌酸肌酶大量漏出等、可利用這些指標評定藥物對心肌細胞缺血樣損傷的保護作用。在攪拌器上 37℃ 水浴消化 10min．自然沉淀后，丟上消液，沉淀的組織塊再加入胰蛋白酶，消化 l0min，然后吹打 1min，自然沉淀，上清移人離心骨中。將自然沉淀的組織塊反復(fù)消化數(shù)次，直至完全分散為止。 體外培養(yǎng)心肌細胞缺氧缺糖性損傷模型的建立方法：取培養(yǎng) 3日的心肌細胞，按下法進行缺氧缺糖實驗．①缺糖：實驗時采用無糖液或不含糖的 Eagle培養(yǎng)基代替正常培養(yǎng)。正常對照組用正常 Hanks液或培養(yǎng)基，不充氮氣，如用二氧化碳培養(yǎng)箱加以培養(yǎng)，則通人 95％ N2+5％ C02氣體形成缺氧。 3．測定指標 (1)形態(tài)學(xué)觀察：用臺盼蘭染色進行死活細胞鑒定，觀察細胞活力的改變及死亡比例，光學(xué)顯微鏡下可觀測心肌細胞形態(tài)變化，如偽足變化、胞泡形成、胞漿顆粒增加、異形 (長形、紡錘形 )心肌細胞的出現(xiàn)。 (2)心肌細胞搏動的變化：包括搏動的頻率、節(jié)律及強度等。 (4)其他：測定細胞內(nèi)氧化物歧化酶的變化從鈣離子運轉(zhuǎn)等。 4．方法學(xué)評價 優(yōu)點：①觀察藥物對心肌細胞的直接作用，可排除藥物通過其他間接影響心肌缺血氧的作用。③適用于從細胞或分子水平進行機制研究。②不適于觀察不溶于水或含雜質(zhì)的粗制藥物，或非直接作用心肌細胞的藥物的作用。 (五 )藥物誘發(fā)心肌缺血模型 近年研究認為冠狀動脈痙攣是導(dǎo)致心肌急性缺血的主要原因之 — ．致心絞痛、心肌梗死和猝死。 l、垂體后葉素誘發(fā)心肌缺血模型 (1)原理：垂體后葉素能使冠狀動脈痙攣，造成急性心肌供血不足，從外周阻力增加．導(dǎo)致心臟負荷加重，心電圖可見心肌缺血的典型變化，適用于緩解冠狀動脈痙攣以防治心肌缺血藥物的初篩方法；垂體后葉素能收縮全身 (特別是內(nèi)臟 )小血管，作用是非特異的。實驗前有心電圖或心律失常異常變化，則棄去不用，根據(jù)所試藥物特點選擇適當給藥途徑和間隔，靜脈給后 1— 5min腹腔注射后 15— 30min，灌胃后 12h，經(jīng)下靜脈或尾靜脈注射垂體后葉素 0． 5或 0． 7u／ kg，注射速度 5s或 l0s。 正常大鼠注射腦垂體后葉素后心電圖變化分兩期： 第一期，注射即刻至 30s， T波升高， ST段抬高 (超過 o． 1mV)，尤以 l0s變化最明顯。 判定標準，以出現(xiàn)第一期或第二期缺血變化為陽性，否則為陰性，比較各組的差異，并做統(tǒng)計學(xué)處理。 判定指標同大鼠。適用調(diào)節(jié)心肌代謝、氧供需平衡及作用于受體藥物的研究； (2)方法：健康大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、貓或犬均可。大鼠、豚鼠和犬每日皮下注射異丙腎上腺素 2— 8mg／ kg，家兔 10— 16mg/kg連續(xù)兩日，第一次和第二次紿異丙腎上腺素后 30min內(nèi)，每隔 5min記錄心電圖一次，第二次給藥后 24h記錄心電圖后殺死動物，取心臟做病理切片檢查。心肌病理觀察可見：白細胞和巨噬細胞浸潤，心肌纖維腫脹、斷裂、橫 紋消失、甚至溶解，發(fā)生玻璃樣變和脂肪變性等。 (3)注意點：適用于研究影響心肌氧代謝平衡或作用受體而防治心肌缺 血的藥物，用心電圖難于定量觀測藥物的作用，須用病理觀測，但制備病理標本及觀察 量較大，難準確定量，是其缺點，可用分級定度或半定量法觀測。這種動物模型 可用以評價通過緩解冠狀動脈痙攣、攻善血液流變性等多種途徑．防治心肌缺血的藥物。 (3)觀測指標：心電圖或體表標測心電圖 ∑— ST及 N— ST改變。生化指標： CPK、血小板聚集、 TXB kelo— PGF等變化。 (4)注意事項：本實驗特點是不開胸，不結(jié)扎冠狀動脈，通過心電圖、血流動力學(xué)、生化 和病理研究以評價抗心肌缺血藥的治療作用。為簡化實驗方法，可試用貓、兔、大鼠或豚鼠 按照垂體后葉素實驗方法進行。因此，心臟血流動力學(xué)指標應(yīng)作為主要藥效學(xué)研 究內(nèi)容。 2．方法 健康犬或小型堵，雌雄兼用，體重 1215kg實驗動物用戊巴比妥鈉 (30mg／ kg) 靜脈麻酐，手術(shù)臺固定，分離氣管并插管，連接電動呼吸機，調(diào)節(jié)潮氣量300— 600ml，動脈氧 分壓維持在如 — 100mmHg，血 ph在正常范圍；左側(cè)第四肋開胸，露心臟，剪開心包，做 心包床：分離冠狀動脈左旋及主動脈根部。左心室尖部插管，連接壓力換能器，測定左室內(nèi)壓，再經(jīng)微分惻定左室內(nèi)壓上升最大速率。股動脈插管測定動脈血壓，以肢體導(dǎo)聯(lián)觀測標準導(dǎo)心電圖并計算心率。將上述各項指標同步錄于多道生理記錄儀。、實驗人員要經(jīng)過嚴格訓(xùn)練，盡量減少對心肌功能的影響。 (七 )冠脈循環(huán)實驗 1．原理 冠脈流量是評價防治心肌缺血藥物的重要指標。研究中，應(yīng)以多種指標綜合分析，了解平衡兩方面的變化，特別是凈效應(yīng)，才能獲得準確的結(jié)論。為了解藥物對缺血區(qū)心肌實際供血情況，可在整體實驗動物中進行冠脈側(cè)支循環(huán)、心肌區(qū)域血流量、心肌營養(yǎng)血流的研究，從不同角度反映藥物對冠脈循環(huán)的影響及防治心肌缺血的療效。實驗動物開胸完成后，分離冠狀動脈左旋支，放置適宜電磁流量探頭，測量冠脈血流量．測定動脈血壓。 冠脈側(cè)支循環(huán)研究方法：實驗用健康成年犬，手術(shù)同前，開胸手術(shù)完成后，分離上動脈根部。在冠脈左前降支下 1／ 3處，分離并結(jié)扎冠狀動脈，于遠端插入冠脈插管。三通的第三臂接橡皮臂，以收集反流量，測量反流壓。分離股動脈，插入動脈管，記錄動脈血壓。停灌后 10 min，分別記錄心輸出量、冠脈反流量及反流壓，動脈壓及心率，作為給藥前對照值，然后給予實驗藥物。 (2)冠狀靜脈竇血流量測定：通過測量冠狀靜脈竇血流量，反映冠脈血流量的變化，約 60％的冠脈血經(jīng)冠脈竇流入右心房。 注意事項：本法研究藥物對犬或貓的冠狀靜脈竇流出量、心肌耗氧量的影響，簡單方便，作為初篩抗心絞痛藥物，能從供血與耗氧兩力面來評價。為尋找治療冠心病藥物，觀測心肌營養(yǎng)性血流量及冠脈總血流兩者配合更有意義。 Rb半衰期為 19． 5日，易于測定，對心肌有特殊的親和力，攝取量為骨骼肌的 2， 5倍，故適用于測定心肌營養(yǎng)血流量。然后將心臟置玻璃研缽內(nèi)．磨成勻漿，放特制鋁箔小皿內(nèi)，在普通燈下烘干，用射線自動標器計數(shù)。 注意：①為防污染，全部操作在盤內(nèi)進行．實驗后一并處理。③每只動物取心臟時所用剪刀、鑷子齊用 — 套．以防不同動物間相干擾。 區(qū)域性心肌血流量的操作方法是用羰化塑料微球懸于含 o． 01％吐慍 80的生理鹽水內(nèi)，使用的置旋渦混合器 I— 2min，取微球 500萬，用生理鹽水稀釋到l0ml， 10s內(nèi)注入麻醉開胸犬左房導(dǎo)管，再用 10ml鹽水沖洗導(dǎo)管：注射微球的同時用恒速泵以 67ml／ min的速度從插人動脈弓的導(dǎo)管連續(xù)取 3份參考樣品，每份 40s。用多導(dǎo)Y能諾分析儀記心肌與參考血樣品的放射。 根據(jù)阻斷冠脈前后心肌組織內(nèi)血流量的變化．減少 25％以上者為缺血，減少大于 75％者為嚴重缺血區(qū)。 (5)離體心臟冠脈灌流法：哺乳動物離體心臟，插管人動脈灌流肘，灌流液須經(jīng)冠狀動脈經(jīng)右心房流出心臟，故流出量可代表冠脈流量，在灌注壓不變的條件下，其流量可反映冠脈阻力的變化。待心臟跳動規(guī)則后，在肺動脈起始處剪一小口，以利冠狀血回流液排出。灌注約 15rain后，連續(xù)測定每分鐘冠脈流量 3次：待恒定后開始給藥，／ H量筒收集流出記錄給藥前后及給藥后每 lmin流出量。 注意事項：藥物的 pH及無機離子含量血接近生理值，否則酸性藥液可增加冠脈流量，須用與藥物同樣 pH及無機離子的對照劑。灌流液必須用新鮮蒸餾水臨時配制。藥物抑制心肌收縮力，可使血管阻力降低．冠脈流量增加，假陽性。用 6V直流電產(chǎn)生的斷續(xù)感應(yīng)電震直接刺激心臟，或用方形波刺激器刺激，也用交流電刺激引起心纖顫，然后測定每 lmin冠脈流量的變化。左心室心肌耗氧量為每分鐘8— 10ml／ 100g(心肌 )，工作負荷增加時每分鐘可達 40ml／100g(心肌 )。心肌氧代謝的研究方法約分為三類。可計算心肌耗氧。心肌缺血時內(nèi)膜下血流及氧張力下降甚于心外股，缺血什損傷及壞死也較外層心肌嚴重，因此，用雙暴露電極測定左心室外／內(nèi)膜下氧張力變化以研究藥物的影響，更有意義。這方法儀器昂貴，國內(nèi)尚未廣泛應(yīng)用，③離體心臟心肌片或心肌組織及體外培養(yǎng)心肌細胞耗氧量測定，離體心臟灌流，分別測定流人液及流小液的含量，可算出心肌耗氧。或測氧儀直接測定心肌片的耗氧量。 2 間接測定 ①張力 — 時間指數(shù)，根據(jù)心肌耗氧量與心臟做功有密切關(guān)系的原理，間接推測心肌耗氧量的變化。 ③正性肌力作用 ，心肌收縮力、心肌縮短速度與心肌耗氧呈線形關(guān)系，凡有正性肌力作用或延長射血時間者，均增加心肌耗氧量，可根據(jù)藥物指標的影響推測心肌耗氧量的變化。①離體心臟灌流耐缺氧實驗，用不同程度的低氧或無氧流液灌流離體心臟，觀察心臟功能、形態(tài)及生化指標的變化，可反映離體心臟對不同缺氧程度的耐受能力以及藥物的影響，并可用于受體作用的研究，但易受體外環(huán)境的影響，須嚴格擰制實驗條件。實驗方法較前者復(fù)雜，但可獲得較多信息，對藥物研究有 — 定實用價值?？蓮钠鞴佟⒔M織及細胞水平反映藥物對心肌耐缺氧能力的影響。用小鼠或大鼠測定速度、存活時間及死亡時余存氧含量，可以較準確的反映出整體動物的耗氧速度及藥物的影響，較前者精細，但亦不能直接說明心肌的耐氧能力，耗氧速度。深入研究藥物對這方面的影響，是必要的。測定動脈血，冠狀靜脈或缺血區(qū)血液乳酸或鉀的含量，較心電圖及血流動力學(xué)更敏感的反映心肌缺氧程度及藥物的影響。 下面重點介紹幾種常用方法。可與實驗中同時測定的其他血流動力學(xué)指標如冠脈血流量、血壓、心電圖等連續(xù)描記于生理記錄儀，進行比較研究。藥前及藥后不同時間抽取血樣進行血氧測定，與其他血流動力學(xué)指標同時紀錄相比較。取血量要適度，避免抽取血量過多而造成缺血。所以當測定系統(tǒng)將電極與被測溶液用能通過氣體分子的聚乙烯薄膜隔開后，在一定極化電壓下電極中測的電流量將只反映破測系統(tǒng)彌散過來的氧，故與被測溶液中的氧分壓成正比，與組織的耗氧成反比，從而可以反映組織的代謝活動。再經(jīng) — 定時間后處死動物，取心肌梗死區(qū)及對照區(qū)心肌組織，于冰浴上切、稱重，加入心肌孵液，于 37℃ 恒