【正文】 細(xì)胞密度可達(dá)108/ml。 懸浮培養(yǎng)法：連續(xù)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞密度可達(dá)2107/ml, 收集的單克隆抗體可達(dá)400 181。 無血清培養(yǎng)法：利用白蛋白、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。加入小牛血清又是發(fā)生支原體污染的原因，而且批間質(zhì)量差異太大，直接影響雜交瘤細(xì)胞的生長(shēngzhǎng)。但由于培養(yǎng)液中含有血清成分，總蛋白量可達(dá)100 181。,單克隆抗體的大量制備 （1）體外培養(yǎng)法：用于抗原免疫性極弱 獲得的抗體較少。o)價(jià)的抗體；反之，則反。 雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目：接近兩親本細(xì)胞染色體數(shù)目的總和，在結(jié)構(gòu)上多數(shù)為端著絲粒染色體外，還應(yīng)出現(xiàn)少數(shù)標(biāo)志染色體。,雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定—染色體分析 正常鼠的脾細(xì)胞染色體數(shù)：40，全部為端著絲粒。,第十五頁，共七十三頁。 免疫熒光技術(shù)適用于細(xì)胞抗原的抗體檢測(cè)，特別是制備以檢測(cè)患者活檢組織標(biāo)本為目的的抗體時(shí)，免疫熒光法則更有意義，在篩選抗體的同時(shí)，還能對(duì)所識(shí)別的抗原進(jìn)行定位判定。通過引入生物素—親和素等放大系統(tǒng)可進(jìn)一步提高靈敏性。)大批標(biāo)本。,篩選陽性克隆與克隆化 因?yàn)榭贵w產(chǎn)生細(xì)胞只占所有脾細(xì)胞的5％左右，所以要進(jìn)行每孔培養(yǎng)上清的抗體活性的篩選工作，以選擇出陽性克隆，然后進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。)樣團(tuán)塊，由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用吸管吸出，移入96孔板培養(yǎng)。第一次克隆化時(shí)也要應(yīng)用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI 1640培養(yǎng)液。,篩選陽性克隆與克隆化 常用的檢測(cè)方法：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù) 常用的克隆化方法：有限稀釋法和軟瓊脂法。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞還能清除死亡細(xì)胞，故應(yīng)用的較多。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞等。 在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中，單個(gè)的或數(shù)量很少的細(xì)胞不易生存與繁殖，必須加入其它活的細(xì)胞才能使其生長(shēngzhǎng)繁殖，加入的細(xì)胞稱之為飼養(yǎng)細(xì)胞。,第十二頁，共七十三頁。脾—脾融合細(xì)胞和瘤細(xì)胞在這樣的組織培養(yǎng)條件下，幾天內(nèi)亦迅速死亡。常用的選擇培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基，它是用次黃嘌吟(H)、氨基喋吟(A)和胸腺嘧啶配制的。xiē)細(xì)胞比脾—瘤融合的雜交瘤細(xì)胞增殖更快，并能將其淘汰。,細(xì)胞融合后，可產(chǎn)生多種融合細(xì)胞，如脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤的融合細(xì)胞，而且還有許多未融合的骨髓瘤細(xì)胞。 （2）如何去除脾瘤融和細(xì)胞以外的細(xì)胞？常用選擇性培養(yǎng)基,第十頁，共七十三頁。jiān)。 為了提高融合率，在PEG 溶液中加入DMSO（二甲基亞砜），以提高細(xì)胞接觸的緊密性，增加融合率。常用濃度為40%~50%，相對(duì)分子質(zhì)量4000為佳。,PEG的相對(duì)分子質(zhì)量和濃度越大，其促融和率越高。)率高 自身不分泌抗體 所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力強(qiáng)且長期穩(wěn)定。,用于細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞的條件： 融和(r243。,第七頁，共七十三頁。,第六頁，共七十三頁。,第四頁，共七十三頁。bāo)與具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的。,第二節(jié) 單克隆抗體(k224。它是抗體研究領(lǐng)域的一次技術(shù)革命，它不用人工免疫動(dòng)物和細(xì)胞融合技術(shù)，完全用基因工程技術(shù)制備人源性抗體。, 1984年報(bào)道了人—鼠嵌合抗體，之后制備出了改型抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識(shí)別單位等多種類型，基本上消除了抗體的鼠源性（免疫源性），相對(duì)分子質(zhì)量只有完整抗體分子的1/80~1/3。 解決問題的方法或途徑—基因工程技術(shù) A、降低McAb的免疫源性； B、降低McAb的相對(duì)分子質(zhì)量。,McAb 在免疫導(dǎo)向療法中存在的困難（障礙）： A、McAb均是鼠源性抗體，應(yīng)用于人體內(nèi)可產(chǎn)生人抗鼠抗體（HAMA），加速了排斥反應(yīng)，在人體內(nèi)的半衰期只有5~6h，難以維持有效藥物作用靶組織時(shí)間； B、完整(w225。 McAb由一個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的，只能識(shí)別某一個(gè)抗原表位的高度特異性抗體。hler and Milstein等首次利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出 McAb. 在臨床上主要用于診斷(zhěndu224。易出現(xiàn)非特異性交叉反應(yīng)。1960年發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞有多種免疫球蛋白。由于病原微生物是含有多種抗原決定族的抗原物質(zhì)，因此制的這些抗體制劑也是多種抗體的混合物，故稱為多克隆抗體。 1975年K246。n)和治療。,第一頁，共七十三頁。nzhěng)的抗體分子的相對(duì)分子質(zhì)量過大，難以穿透實(shí)體腫瘤組織，達(dá)不到有效的治療濃度。,第二頁，共七十三頁。 1994年Winter創(chuàng)建了噬菌體抗體庫 技術(shù),以基因工程方法制備抗體并發(fā)展(fāzhǎn)成抗體工程。,第三頁，共七十三頁。ngtǐ)及其改造（Monoclonal Antibody）,一、制備單克隆抗體的一般流程 McAb是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞(x236。由于這種抗體是針對(duì)一個(gè)抗原決定簇的抗體，又是單一的B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的，故稱為單克隆抗體。,第五頁，共七十三頁。,抗原與動(dòng)物免疫 免疫方法：體內(nèi)免疫和體外免疫 抗原：顆粒性抗原和可溶性抗原 免疫動(dòng)物：BALB/c小鼠和Lou大鼠 細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng) 基本(jīběn)方法：取適量脾細(xì)胞（1108）與骨髓瘤細(xì)胞（2107~3107）進(jìn)行混合，在PEG作用下誘導(dǎo)它們?nèi)诤希瑫r(shí)間控制在2min以內(nèi)，然后用培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋 。,第八頁，共七十三頁。nɡ h233。,第九頁，共七十三頁。但其黏度和對(duì)細(xì)胞的毒性也隨之增大。相對(duì)分子質(zhì)量在400~6000，濃度在10%~60%范圍內(nèi)的PEG都能使細(xì)胞發(fā)生融合。但必須嚴(yán)格限制接觸時(shí)間(sh237。 （1）細(xì)胞融合液中的細(xì)胞類型：4或5種。,第十一頁，共七十三頁。這些(zh232。 為此，可再將融合后的細(xì)胞立即移入選擇性培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。其中氨基喋吟(A)能阻斷DNA合成的主要途徑，瘤—瘤融合細(xì)胞和瘤細(xì)胞因不能合成DNA而死亡。 由于骨髓瘤細(xì)胞都是次黃嘌吟鳥嘌吟磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)缺乏株，脾細(xì)胞內(nèi)卻有這種酶，因此脾—瘤融合的雜交瘤細(xì)胞可利用HGPRT酶，用次黃嘌吟(H)和胸腺嘧啶合成DNA，使雜交瘤細(xì)胞得以生長。,在最適的培養(yǎng)條件下．大約有105個(gè)脾細(xì)胞才能形成一個(gè)雜交瘤細(xì)胞，大量瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)液中相繼死亡，單個(gè)或少數(shù)的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活。所以通常要加入飼養(yǎng)細(xì)胞才能使其繁殖。一般認(rèn)為飼養(yǎng)細(xì)胞能釋放某些生長刺激因子，并能滿足雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度的依賴性。,第十三頁，共七十三頁。 有限稀釋法：把雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋后，加入到96孔板，使每孔中在理論上只含有一個(gè)細(xì)胞。 軟瓊脂法：在培養(yǎng)