臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)考試輔導(dǎo)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)-展示頁(yè)
2024-10-13 14:03本頁(yè)面
【正文】 。二、酶標(biāo)記抗體或抗原（一）酶標(biāo)記抗體或抗原的制備標(biāo)記方法應(yīng)符合：技術(shù)方法簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高，且重復(fù)性好；標(biāo)記反應(yīng)不影響酶和抗原或抗體的活性；酶標(biāo)志物穩(wěn)定，應(yīng)避免酶、抗體（抗原）以及酶標(biāo)志物各自形成聚合物等。常用對(duì)硝基苯磷酸酯（pNPP），pNPP經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對(duì)硝基酚，最大吸收峰波長(zhǎng)為405nm。缺點(diǎn)是水溶性差。（2）四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：TMB經(jīng)HRP作用后變?yōu)樗{(lán)色，加入硫酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色，最大吸收峰波長(zhǎng)450nm。OPD在HRP的作用下顯橙黃色，加強(qiáng)酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，最大吸收峰在492nm波長(zhǎng)。因人血中缺乏此酶，以其制備的酶標(biāo)志物在測(cè)定時(shí)不易受到內(nèi)源性酶的干擾，從而提高特異性，被用于均相酶免疫測(cè)定。（AP）：大腸桿菌來(lái)源的AP分子量80kD，；小牛腸黏膜AP分子量為100kD，；后一種AP的活性高于前者。酶活性以單位U表示：即1分鐘將1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。輔基是酶活性基團(tuán)，而主酶則與酶活性無(wú)關(guān)，HRP的純度用RZ（HRP分別在403nm和275nm處的吸光度比值）表示。（二）常用的酶（HRP）：目前酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中應(yīng)用最廣泛的標(biāo)記用酶。，方法簡(jiǎn)單易行、敏感和重復(fù)性好。，酶活性不受樣品中其他成分的影響，受檢組織或體液中不存在與標(biāo)記酶相同的內(nèi)源性酶或抑制物。用于標(biāo)記的酶應(yīng)符合：，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，純度高。第九章 酶免疫技術(shù)第一節(jié) 酶免疫技術(shù)的特點(diǎn)它是將酶與抗體或抗原結(jié)合成酶標(biāo)記抗體或抗原，在酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)完成后，加入酶的相應(yīng)底物，通過(guò)酶對(duì)底物的顯色反應(yīng)，對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測(cè)定分析。一、酶和酶作用底物（一）酶的要求：一個(gè)酶蛋白分子每分鐘可催化103～104個(gè)底物分子轉(zhuǎn)變成有色產(chǎn)物。，標(biāo)記后酶活性保持穩(wěn)定，且不影響標(biāo)記抗原與抗體的免疫反應(yīng)性。用于均相酶免疫測(cè)定的酶還要求當(dāng)抗體與酶標(biāo)抗原結(jié)合后，酶活性可出現(xiàn)抑制或激活。、輔助因子及其底物對(duì)人體無(wú)害，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物應(yīng)價(jià)廉易得。由無(wú)色的糖蛋白（主酶）和亞鐵血紅蛋白（輔基）結(jié)合而成的復(fù)合物。RZ值僅說(shuō)明血紅素基團(tuán)在HRP中的含量，并非表示HRP制劑的真正純度，而且RZ值高的HRP并不意味著酶活性也高，RZ值與酶活性無(wú)關(guān)。酶變性后，RZ值不變但活性降低，因此使用酶制劑時(shí)，酶活性單位比RZ值更為重要。（βGal）：βGal來(lái)源于大腸桿菌。（三）常用的底物（1）鄰苯二胺（OPD）：是HRP最為敏感的色原底物之一。OPD應(yīng)用液穩(wěn)定性差，易變色，需新配制后在1小時(shí)內(nèi)使用，顯色反應(yīng)過(guò)程需避光，而且具有致癌性。TMB穩(wěn)定性好，成色無(wú)需避光，無(wú)致突變作用，是目前ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。（3）其他：5氨基水楊酸（5ASA）和2，2聯(lián)氮二（3乙基苯并噻唑6磺酸）二銨鹽（ABTS）。（βGal）的底物常用4甲基傘酮基RD半乳糖苷（4MUU），酶作用后，生成高強(qiáng)度熒光物4甲基傘形酮（4MU），其敏度性較HRP高30～50倍，但測(cè)量時(shí)需用熒光計(jì)。
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